Summary
פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש להקמת, טיפול, הקלטה מ - ו - גירוי חשמלי תרבויות על MEAs.
Abstract
במשך המאה שעברה, מדעני מוח רבים ברחבי העולם הקדישו את חייהם כדי להבין איך רשתות נוירונים לעבוד ומדוע הם מפסיקים לעבוד במחלות שונות. מחקרים כללו תצפית neuropathological, מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם תיוג גנטית, הקלטה תאיים הן נוירונים ניתק וההכנות פרוסה. פרוטוקול זה דן אחר הטכנולוגיה, הכוללת גידול תרביות נוירונים ניתק על מיקרו אלקטרודה arrays (המכונה גם רב אלקטרודה arrays, MEAs).
ישנם יתרונות מרובים באמצעות מערכת זו על פני טכנולוגיות אחרות. תרבויות העצבית ניתק על MEAs לספק מודל פשוט יותר שבו פעילות הרשת ניתן להשפיע עם רצפים גירוי חשמלי באמצעות אלקטרודות מרובים של המערך. כי הרשת היא קטנה, ההשפעה של גירוי מוגבל לאזורים הנצפה, וזה לא המקרה ההכנות ללא שינוי. התאים גדלים בשכבה ביצוע שינויים במורפולוגיה קל לעקוב עם שיטות הדמיה שונות. לבסוף, על תרבויות MEAs יכולים לשרוד במשך למעלה משנה במבחנה אשר מסירה את כל המגבלות זמן ברורה הטבועה culturing עם טכניקות אחרות. 1
המעבדה שלנו ואחרים ברחבי העולם הם ניצול הטכנולוגיה הזו לשאול שאלות חשובות לגבי רשתות נוירונים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק את המידע הדרוש להקמת, טיפול, הקלטה מ חשמלית מגרה תרבויות על MEAs. ברשתות במבחנה לספק אמצעי פיזיולוגית לשאול שאלות רלוונטיות על הרשת ורמות הסלולר המובילה להבנה טובה יותר של המוח לתפקד תפקוד לקוי.
Protocol
הקדמה
יש מיליארדים של נוירונים במוח האנושי. כל אחד מן הנוירונים האלה יכולים להיות מאות עד אלפי חיבורים לעתים קרובות פעמים עם תאים רבים ושונים. קשרים אלה בנמל אותות המאפשרות לנו ללכת, לשחק פסנתר, לרכב על אופניים, לצחוק, לבכות, לזכור. במשך המאה שעברה, מדעני מוח רבים ברחבי העולם הקדישו את חייהם כדי להבין איך רשתות נוירונים לעבוד ומדוע הם מפסיקים לעבוד במחלות שונות.
ישנם כלים רבים אפשר להשתמש כאשר לוקחים על משימה זו בלתי עביר לכאורה. מחקרים ראשוניים התמקדו תצפית neuropathological כיצד מעגלים עצביים מאורגנים במוחם של בני אדם ובעלי חיים אחרים. הופעתו של מיקרוסקופ פלואורסצנטי וסימון גנטי הרחיב את היקף המחקרים הללו מבניים לחקור הרכב הסלולר עד לרמת חלבון ה-DNA.
אך ניסויים אלה לא התייחס לתפקוד דינמי של המוח, אלא רק את הסדר סטטי. להבנה פעילות עצבית מתמשך, טכניקות פופולרי בדרך כלל מתמקדים לבחינת הפעילות אלקטרו עם הקלטה תאיים. עצב יחיד של תרבויות ניתק לספק מודל שימושי רדוקציוניסט, אולם טכניקה זו היא מוגבלת על ידי מרווחי זמן קצרים הקלטה מ תאים בודדים. מודל זה גם מספק מידע מוגבל על תאים אחרים ברשת. פרוסות המוח של מכרסמים לספק יותר של מודל מציאותי שבו הארכיטקטורה קליפת המוח נשמר. אבל פרוסות כאלה, גם כאשר בתרבית, יש אורך חיים מוגבל והוא יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית כדי להישאר בחיים, תוך שמירה על cytoarchitecture 2.
טכנולוגיה נוספת כרוכה גדל תרבויות העצבית ניתק על מיקרו אלקטרודה מערכים (נקרא גם אלקטרודה רב מערכים, MEAs). נוירונים הם מצופה על MEAs אשר microelectrodes מוטבע בתחתית המנה. במשך שלושה שבועות, תרבויות אלה יוצרים רשת של נוירונים להשלים עם אקסונים, דנדריטים מאות אם לא אלפי של קשרים סינפטיים. ישנם יתרונות מרובים באמצעות מערכת זו על פני טכנולוגיות אחרות. תרבויות העצבית ניתק על MEAs לספק מודל פשוט יותר שבו לעבוד (בסדר גודל של עמודה קורטיקלית אחת במקום מוח שלם). התאים גדלים בשכבה ביצוע שינויים במורפולוגיה קל לעקוב עם שיטות הדמיה שונות. פעילות רשת ניתן להשפיע עם רצפים גירוי חשמלי באמצעות אלקטרודות מרובים של המערך. כי הרשת היא קטנה, ההשפעה של גירוי מוגבל לאזורים הנצפה, וזה לא המקרה ההכנות ללא שינוי. לבסוף, על תרבויות MEAs יכולים לשרוד במשך למעלה משנה במבחנה אשר מסירה את כל המגבלות זמן ברורה הטבועה culturing עם טכניקות אחרות. 1 לכן, על תרבויות MEAs מייצגים מודל אידיאלי ללימוד קישוריות עצבית.
המעבדה שלנו ואחרים ברחבי העולם הם ניצול הטכנולוגיה הזו לשאול שאלות חשובות לגבי רשתות נוירונים. תהליכים עצביים נוכחי הנלמד עם דגם זה כוללים רשת דינמיקה, התפתחות, למידה וזיכרון, הפלסטיות הסינפטית, excitotoxicity, איסכמיה ו ניוון מוחיים. 3-10 ממצאים ממחקרים אלה עשויות להיות השלכות משמעותיות על הקמת טיפולים טובים יותר עבור מחלות אנושיות כמו מומים מולדים, אפילפסיה , שבץ ומחלת אלצהיימר. מטרת פרוטוקול זה היא לספק את המידע הדרוש להקמת, טיפול, הקלטה מ ומגרה תרבויות על MEAs. המטרה הסופית היא לספק אמצעי החוקרים לשאול את השאלות הרלוונטיות פיזיולוגית ברמה התאית רשת אולי להוביל להבנה טובה יותר של תפקוד המוח ותפקוד לקוי, ובסופו של דבר את הטיפול של מחלות המשפיעות על נוירונים שלנו וכיצד הם מתקשרים.
פרוטוקול הבאה מייצגת מעל 10 שנות ניסיון מהמעבדה שלנו culturing, הקלטה מ ומגרה רשתות נוירונים על אלקטרודות מיקרו מערכים. כל צעד עבר אופטימיזציה כדי להוביל לפיתוח של רשתות נוירונים ששרדו ארוך ובריא. הפניות ניתנים שבו זמין תוך כמה הגדרות אופטימליות קבענו אמפירית. לפני שיזם את הפרוטוקול, לקבל ציוד ואספקה ולהכין פתרונות כמפורט בסעיף שכותרתו "חומרים." סעיף ב 'Dissection המוח "יידונו בקצרה, אך לא הפגינו וידאו הנלווה כמו ג'ורנל אחרים של מאמרים ניסוי דמיינו לכסות את הנושא הזה 11.
ב Dissection המוח
- מוח שלם המחולצים עוברי חולדות יום 18 (E18). מתוזמן בהריון חולדות נקבות מורדמים עם isoflurane בשאיפה ערופה. עוברים יוסרו גזור על פי GUID המועצה הלאומית למחקר שלדואר לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי אוניברסיטת אמורי IACUC.
- תוך שימוש בטכניקה aseptic, המוח העוברי יוסרו להציב פתרון מאוזן מלחים קר של האנק (HBSS) בתוך צלחת פטרי 100 מ"מ סטרילי. שאר פרוטוקול לנתיחה מתרחשת תחת מיקרוסקופ לנתח במנדף זרימה למינרית כדי למזער את הסיכון לזיהום.
- מוח החולדה מועברים אחד בכל פעם כדי המנה השנייה פטרי סטרילי עם HBSS לנתיחה. אמנם שקוע HBSS, את גזע המוח התלמוס המוח הקטן הם לחתוך את האונות החצוי.
- גבשושית חוש הריח הוא מנוצל כמו ידית להבטחת בחצי הכדור בעדינות תוך כדי להסיר את קרומי המוח.
- קליפת המוח היא קלופים אז מן ההיפוקמפוס בסטריאטום הבסיס ומאוחסנים שפופרת 15 מ"ל סטרילי חרוטי בפתרון שינה על הקרח. 12 מאחר שיש מספר רב של עוברים בדרך כלל, הליך זה חוזר על עצמו ואז בהתאם למספר הרצוי של MEAs להיות מצופה את צפיפות התאים הרצויים. הקורטקס משולבים בתהליך תא דיסוציאציה כמפורט להלן. קליפת המוח עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס פתרון שינה עד 24 שעות לפני הניתוק עם הפסד מינימלי בלבד של כדאיות התא. כחלופה רקמות ניצול גזור in-house, רקמת המוח גזור ניתן לרכוש חתיכות המוח ( www.brainbitsllc.com ).
ג MEA הכנה דיסוציאציה קליפת המוח
- MEAs מתקבלים ALA מדעי ( www.alascience.com ), ספק עבור היצרן, Multi-Channel מערכות. קיימות מספר תצורות שונות של MEAs עם וריאציות אוריינטציה אלקטרודה ומרווח, נוכחות או העדר נוכחות פנימית אלקטרודה, הקרקע או העדר טבעת זכוכית, בגודל של טבעת הזכוכית. על הניסויים הבסיסיים שלנו אנו משתמשים במערך תקן מיקרו אלקטרודה המכילה 60 אלקטרודות 8 בתיאום 8 רשת עם טבעת זכוכית קטן. טיטניום ניטריד קוטר אלקטרודה הוא 30 מיקרומטר ואת המרחק בין מרכזי אלקטרודה הוא 200 מיקרומטר. אחת האלקטרודות גדול יותר פונקציות כמו הקרקע או אלקטרודה השוואתית פנימית. כאשר הטיפול MEAs, חשוב וחיוני לא עצמים מוצקים (למשל, עצות פיפטה, ממחטות הנייר, או שוטרים גומי) אי פעם לגעת בפנים של המנה כמו זה יכול לגרום נזק אלקטרודות. מידע מפורט יותר על MEAs וטיפול ניתן למצוא במדריך למשתמש MEA ( www.multichannelsystems.com / מוצרים, מאה / microelectrode-arrays.html ).
- בערב לפני הכנת התא, MEAs הם שטופים במים דה מיונן אז מותר לטבול אתנול 70% במשך 15 דקות. המנות מונחות אז עם אור UV על לילה ברדס זרימה למינרית. לצורך הטיפול, MEA כל ממוקם רף 100 מ"מ צלחת פטרי סטרילית קלקר עם תאריכים תיוג דגש על צלחת פטרי. ראוי לציין, טכניקות אחרות, כולל עיקור מעוקר וניצול המים 90 מעלות צלזיוס מוזכרים במדריך MEA המשתמשים. עם זאת, מצאנו כי אמפירית מעוקר נראה להקטין את מספר הפעמים MEA ניתן להשתמש. אם אתה חוזר MEAs כי כרגע יש תרבויות, ואז החומר האורגני יש להסיר. 300-400 μl של טריפסין 0.25% ב PBS היא מודגרות על MEA ב 35-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. MEA היא שטפה עם מים מיוננים דה ובחן אז עם מיקרוסקופ אור. אם העניין הסלולר עדיין, אז בשלב טריפסין חוזר על עצמו עד נקיים. אם המנה נקי, ולאחר מכן להמשיך לשלב עיקור לעיל. באופן כללי, MEAs ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות את הטיפול המתאים.
- גם בערב שלפני ציפוי, המכסים MEA מוכנים ו autoclaved. העפעפיים הם בהתאמה אישית, אך ניתן גם לרכוש מ-ALA מדעי. הן עשויות טפלון polytetrafluoroethylene יש קרום ברור (fluorinated אתילן, פרופילן טפלון) נמתח לרוחב החלק העליון. הממברנה מאפשרת דיפוזיה של גזים אך מגביל את הדיפוזיה של המים ובכך למעשה ביטול הצורך באווירה humidified ומניעת השפעות מזיקות של אידוי hyperosmolarity 1.
- לאחר דיסקציה לעיל תושלם, הכנה MEA הוא המשיך על ידי הצבת 100 μl של פתרון (PEI) polyethyleneimine למרכז כל MEA. 13 בידינו פתרון PEI מספק פחות אשכולות של תאים MEA מאשר שימוש polylysine. המנה מותר לשבת בטמפרטורת החדר בשכונה זרימה למינרית במשך 30 דקות עם מכסים קלות נח על MEAs כדי למנוע אידוי. להזכירך, כל עבודה עם MEA לפתוח או ברקמת המוח צריך להתקיים ברדס תקן תרבית תאים למינרית לזרום מינימייז את הסיכון לזיהום.
- MEA היא שטפה אז 3 פעמים עם 1-2 מ"ל מים מיוננים דה סטרילית. זרימה למינרית אידיאלי ברדס הגדרת יכלול מנגנון aspirator להסרת נוזל הכלים. טיפ פיפטה סטרילית 200μl יכול להיות מחובר בצינור aspirator. אל תיגע את פני השטח של MEA בעוד aspirating כמו זה יכול לגרום נזק אלקטרודות. לאחר השטיפה הסופית, MEA הוא להתייבש במשך 30 דקות לפחות בשכונה זרימה למינרית.
- במהלך תקופה זו ייבוש, התהליך הוא ניתוק עצבי אשר נכתבו על ידי הצבת הקורטקס לתוך 2 מ"ל של תמיסת papain בתוך בקבוקון 15 מ"ל חרוטי פלסטיק סטרילית. 1 50 μl של DNAse מתווסף לתערובת. בקבוקון ממוקם לתוך אמבט מים 35-37 מעלות צלזיוס מודגרות למשך כ 20 דקות. לטפוח בעדינות את הפתרון עבור כל 5 דקות ערבוב להיות זהיר, כדי למנוע החדרת בועות. קליפת המוח צריך להתחיל לקחת על מראה מטושטשת כמו התמורה העיכול.
- הפתרון papain לאחר מכן הוסרו בקפידה על ידי pipetting לעזוב את קליפת המוח בתוך הבקבוקון חרוטי 15 מ"ל. 2 מ"ל של המדיום הסלולרי מתווסף הקורטקס, מותר דגירה של 2-3 דקות ולאחר מכן להסיר בעדינות. זאת על מנת לשטוף את כל papain שיורי, אשר יהיה גם מעוכבים על ידי נסיוב של המדיום. 2ml נוספת של המדיום הסלולרי מתווסף הקורטקס וזה המדגם הוא vortexed אז עבור 5-10 שניות על מהירות גבוהה. לא צריך להיות פתרון מעונן בחלקו התחתון של המכל חרוטי 15 מ"ל ולא חתיכות המוח הנותרים. לחלופין, טחינה דקה עם 1 מ"ל של המדיום על ידי 3 פעמים באמצעות כף יד P-1000 פיפטה יכול להיות מנוצל עבור dissociating הרקמה. 1 לקבלת טחינה דקה נאותה, כל שבץ פיפטה צריך לקחת שנייה אחת.
- הפתרון הוא מותר ואז לעבור בעדינות דרך מסננת תא סטרילי 40μm באמצעות כוח הכבידה. לאט לאט להוסיף את פתרון התא טיפה אחת בכל פעם לתוך מסננת עם P-1000. 35 צלחת פטרי סטרילית מ"מ מנוצלים לאיסוף פתרון תא מתוח.
- ההשעיה התא מועבר אז אל חרוטי בקבוקון 15 מ"ל ובינוניים תא נוסף בנפח סופי של 4.0 מ"ל. 14
- 500 μl של פתרון BSA 5% w / v אז הוא מרובד היטב עם P-1000 לתוך החלק התחתון של הבקבוקון חרוטי 15 מ"ל. 14 זה יתפוס את מקומו של התא המכיל למעלה פתרון הבקבוקון.
- פתרון התא עם BSA שכבתית בתחתית הוא centrifuged אז XG 200 במשך 6 דקות להסיר פסולת קטנים תוכן תאיים רעילים. 14
- במהלך השלב צנטריפוגה התא, MEAs הם העריכו חזותית כדי לוודא שהם יבשים לחלוטין. 20 μl של פתרון laminin הן מכן הניח בזהירות למרכז של MEA להבטיח כי כל האלקטרודות מכוסים. 1 הימנעו החדרת בועות אוויר לתוך הפתרון הזה מאז שיכול להוביל הכנה לקויה של משטח אלקטרודה. אם MEA אינו יבש לחלוטין, אזי ירידה של laminin יתפשט על פני צלחת בפוטנציה ולכן קשה יותר כראוי למקם את התאים על פני האלקטרודות כאשר ציפוי. שלב זה הוא מאוד עדין ויש לו פוטנציאל לגרום נזק לפני השטח MEA ביד רועדת או פקיעה של תשומת לב.
- מכסים טפלון ממוקמים על גבי MEA בשלב זה כדי למנוע אידוי של laminin. המיקום של מכסה גם עדין. המכסה צריך רק להציב או להסיר כאשר MEA הוא על משטח שטוח לחלוטין. אחרת, כוחות נוסף המופעל על ידי משטח מחוספס עלולה לסדוק את תחתית כוס של המערך טיוח זה לא שמיש. צלחת ממוקם אז במשך 20 דקות לתוך החממה.
- בעוד laminin הוא מחייב את המנה, בקבוקון המכיל 15 מ"ל חרוטי התאים יוסר בצנטריפוגה והועברו בחזרה למכסה המנוע זרימה למינרית. גלולה צריך להיות גלוי בחלקו התחתון של המכל. Supernatant הוא הוציא בזהירות עם פיפטה 5 מ"ל סטרילי סרולוגיות פלסטיק. שמור את supernatant במקרה תהליך צנטריפוגה לא היה שלם. גלולה היא resuspended אז בעדינות או על ידי טחינה דקה עם P-1000 או מערבולת מהירה μl 300-500 של המדיום הסלולרי תלוי התשואה הצפויה. 10 μl של תאים ההשעיה הוסרה והניח על hemacytometer כדי לקבוע ריכוז התא. אם התשואה נמוכה, לנתח את supernatant תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע אם צעד צנטריפוגה לא היה שלם. צנטריפוגה חזור עשוי להיות נחוץ. אם התשואה היא גבוהה, אז דילול עשוי להיות הכרחי ספירה מדויקת יותר. ציפוי צפיפות התאים יכולים לנוע בין 5000 ל 300,000 תאים לכל MEA. חישוב הדילול כך את המספר הרצוי של תאים עבור ציפוי הוא בנפח סופי של μl 15-20. אנו משתמשים בדרך כלל ריכוז סופי של 1,000-3,000 תאים לכל μl. זוג אחד של קליפת המוח התשואה תהיה בדרך כלל בין 10 ל -15 מיליון תאים. מספר זה עשוי להיות נמוך מעט טחינה דקה אם הוא מנוצל.
- בשלב זה, לאהוא laminin הדגירה על MEA צריכה להיות מוחלטת. מכסה טפלון יוסר MEA ורוב הירידה laminin הוא ואקום aspirated או pipetted משם. ואז μl 15-20 ההשעיה התא הרצוי pipetted מיד על האזור הרטוב של laminin שיורית. היזהר, כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך נפח קטן זה של השעיה תא כמו בועות אוויר יכולים למנוע מתאי שווה מכסה את כל האלקטרודות. המכסה מוחלפת בעדינות MEA ממוקם בקפידה לאחור במשך 30 דקות בחממה. המנה נבדק ולאחר מכן תחת מיקרוסקופ אור על מנת להבטיח כי התאים דבקו ולכסות את כל האלקטרודות. אם כל האלקטרודות אינן מכוסות, ואז התאים יותר ניתן להוסיף את MEA הוא החזיר עם מכסה בחממה על מנת לאפשר לתאים חדשים אלה לדבוק. אם צינור ההשעיה תא משמש יותר מאשר כמה דקות לאחר יושב באין מפריע, כדי להיות בטוח מערבולת בעדינות אותו resuspend תאים התיישבו. לאחר כיסוי אלקטרודה מתאימה מושגת, ולאחר מכן את המנה מוצף לאט עם 1ml של חם (35-37 מעלות צלזיוס) המדיום הסלולרי. מכסה טפלון מוחלף ואת צלחת ממוקם חזרה בחממה. מכסה המנוע זרימה למינרית יכול במהירות יבש הכרכים laminin קטנים ההשעיה כרכים תא פעם על MEA כך דואגים לשמור עליהם חתום העפעפיים טפלון. הסביבה האידיאלית חממה עבור MEAs אטום היא 5% CO 2, 9% O 2 ו - 65% לחות ב 35-37 ° C. מתח חמצן נמוכה חשובה לטווח ארוך תרבויות, הפחתת נזק חמצוני. 12 לחות 65% שמירה מפחית התאדות דרך הממברנה טפלון (לעומת שליטה ללא לחות) ומאפשר MEA אלקטרוניקה לשמש בחממה ללא נזק עיבוי מים (כמו עם חממה רגילה humidified כדי הרוויה).
ד שינוי המדיום הסלולרי וטיפול תרבויות ניתק על MEAs
- ביום שאחרי ציפוי התא, לבדוק את MEA תחת מיקרוסקופ אור. אם צבע של המדיום היא עדיין אפרסק עד בצבע אדום ויש כמות מוגבלת של פסולת תאית מוות של תאים, ולאחר מכן לשנות את המדיום הראשון יכול להתעכב ליום אחר. עם זאת, אם המדיום הוא החל להופיע יותר כתום או צהוב בצבע ו / או יש כמות גדולה של פסולת תאית מוות של תאים, ולאחר מכן לשנות את המדיום. כל השינויים בינוני צריך להתרחש ברדס תקן תרבות התא זרימה למינרית.
- השינוי בינוני הראשונה מורכבת של הסרת המכסה MEA, aspirating את כל המדיום בצלחת, להחליף את כמות הסיר עם המדיום הסלולרי טרי, ולאחר מכן להחליף את המכסה. החלף את כל הסכום של המדיום הסלולרי על שינוי המדיום הראשון להסיר כל פסולת הסלולר הנותרים מתהליך ציפוי. שינויים בינוני לאחר צריך רק לשאוב ממנו כמחצית בינוני ואחריו להחליף את כמות הסיר עם מדיום חדש. זה מאפשר לכמה גורמי גדילה כי כבר מופרשים לתוך המדיום הסלולרי להישאר עם התאים ושמירה על הסביבה גוברת אופטימלי יותר. אם החלק התחתון של המכסה מזוהם במהלך תהליך שינוי בינוני או אם המכסה מראה סימנים של נזק או רפויה, ואז לנצל מכסה autoclaved חדש. בינוני תא ניתן לאחסן בחממה במיכל סטרילי עם מכסה שונה מותאמים אישית (בעל קרום (fluorinated אתילן, פרופילן) טפלון כדי לאפשר מחלף גזי). בינוני נייד יכול גם להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס אבל חם לאזן זה בחממה לפני מדיום משתנה.
- הסר להחליף כמחצית המדיום בצלחת בערך פעמיים בשבוע. חלק בהכנות התא עלול להוביל שינויי צבע מהירה יותר במדיום גרימת צורך בשינויים תכופים יותר. אם המדיום הוא ציין להיות צהוב, ואז לשנות את כל הסכום של המדיום. מעבר מהיר צהוב יכול להיות גם סימן לזיהום כל כך לבדוק את צלחת תחת מיקרוסקופ אור סימנים חזותיים של זיהום.
- בהתאם לתנאי התנסות בטכניקה סטרילית, תרבויות, כי כבר היה אכפת בקפידה יכול לשרוד יותר משנה. 1
E. הקלטה מ MEAs
- MEA לכל אחד יש 59 אלקטרודות הקלטה אחת אלקטרודה הקרקע פנימי. קיימות מספר מערכות הקלטה מסחרי זמין, כמו גם גרסאות בהתאמה אישית. הספקים כוללים Multi-Channel מערכות, טאקר דייויס טכנולוגיות, AXION Biosystems, אלפא מד מדעי MED64, Plexon, Ayanda Biosystems ו ביולוגיים. המעבדה שלנו משתמשת כרגע התקנה מסחרית של מערכות Multi-Channel, מנהג שנועד מערכת מבוססת Windows שנקרא NeuroRighter 15, וכן אישית מעוצבת מערכת מבוססת לינוקס בשם 16 MeaBench. כל המערכות הללו הוא מסוגל להקליט MEAs (Multi-Channel Systems) באמצעות מגבר קדם Multi-Channel מערכות. התקנה מסחרית של טאקר דייויס טכנולוגיות היא גם בשימוש. פרוטוקול זה יהיה להדגים הקלטה מ MEAs עם NeuroRighter. Neתוכנה uroRighter הוא קוד פתוח והוא זמין להורדה בחינם ביחד עם עיצובים חומרה NeuroRighter קבוצות Google. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
- תרבויות על MEAs לקחת 2-3 שבועות כדי להגיע למצב יציב של הפעילות. 17,18 פעילות זו כוללת פוטנציאל פעולה ספונטנית תרבות רחב מתפרצת (מטח פוטנציאל הפעולה מתפשט ברחבי synaptically תרבות). אופי הניסוי אך יקבע את המספר האידיאלי של ימים במבחנה לפני ההקלטה.
- הפעילות העצבית תלויה בתנאים סביבתיים אידיאלי כולל טמפרטורה ו-pH. 1 כתוצאה מכך, הקלטה שלנו מתקיים בחממה כפי שתואר לעיל. אם הניסויים קצר (<30 דקות) נועדו, יש גם מודול חימום זמינים מסחרית כי ניתן לחבר מגבר קדם MCS לשמירה על הטמפרטורה האידיאלית MEA.
- כדי להתחיל להקליט, MEA (עדיין בצלחת פטרי שלה) מועבר בעדינות מן האינקובטור אחסון ההקלטה חממה. שמור את החלק התחתון של צלחת במקביל לקרקע. הימנע תנועות מהירות עם MEA MEA או צורם כמו אלה יכולים לנתק את התרבות מן המצע. MEA מוסר אז מצלחת פטרי והושמו מגבר קדם את ההקלטה. התאם את הקרקע הפנימית אלקטרודה המנות אנחנו כרגע הוכחת עם אלקטרודה הקרקע על מגבר קדם (ערוץ CR15 עבור מגבר קדם MCS). נגב את המגעים סביב היקף של MEA באמצעות רקמה ספוגית או צמר גפן טבולה אתנול 70% כדי להסיר טביעות אצבעות או פסולת אחרים שעשויים לעכב חיבור טוב. לאחר שווידאת כי MEA ממוקם כראוי, המכסה מגבר קדם הוא הוריד אז נצמד למקומו. המגעים על מכסה מגבר קדם צריך לנוח היטב על הקשר רפידות אלקטרודה על MEA. ראייה לבדוק יישור קשר ולהתאים במקלון צמר גפן במידת הצורך. מניחים את המכשיר על preamp Peltier בחממה. זו מורכבת משתי צלחות נחושת עם משאבת חום Peltier תרמואלקטרי דחוקה ביניהם. אנחנו רצים זה בערך 5V, כדי להסיר חלק החום המיוצר על ידי המעגלים preamp. זה מונע עיבוי מ טביעה בצד הפנימי של המכסה את הממברנה טפלון. התעבות כל יצביע לפגוע בתרבות ידי עלייה osmolarity של המדיום במגע עם תאים, עקב התאדות. על ידי הבטחת כי preamp ובינוניים הם במעלה או שתיים מתחת לטמפרטורה בחממה אוויר, שינויים osmolarity הן מזעריות.
- הפעל את אספקת החשמל כדי NeuroRighter ולפתוח את התוכנה על תחנת העבודה. התאם את הגדרות NeuroRighter אל מבחנה עם תצורות תוכנה / חומרה מתאימה גם במקום. בחר את מספר אלקטרודות בתוכנה. על מנת להפחית את כמות רעשי רקע, פילטר דיגיטלי הלהקה עוברים ניתן להפעיל. בחר קובץ נתונים עם הבורר שיא על אם הנתונים יישמרו לצורך ניתוח מאוחר יותר. הפעל את לחצן התחל פעם אחת את כל ההגדרות המתאימות נבחרים.
- המסך צריך להראות ריצה עקבות של פעילות רעשי רקע. פוטנציאל פעולה מדי פעם התפרצויות צלחת רחבה של פעילות צריך להיות גלוי. הקטע שלהלן על פתרון בעיות הקלטה מ MEAs ידונו הבעיות הנפוצות כמה אם הפעילות הצפויה לא דמיינו.
- תצוגת המסך ניתן לשנות את מצב זיהוי ספייק (הכרטיסייה 'Spk Wfms') שבו פוטנציאל פעולה סטטי מוצגים כפי שהם מתרחשים בחלונות זמן 3ms. עבור ערוץ נתון, פוטנציאל ממשי לפעולה תאית צריך להימשך כ 1ms ויש אש שוב ושוב באותו כיוון (חיובי או שלילי). מדי פעם, שתיים או יותר נוירונים יכולים להיות גלויים על האלקטרודה זהה עם קטבים שונים. Spikes עם כמובן זמן קצר הקוטביות משתנה הם תוצר סביר. איור 1 מציג עלילה סריקה של נתונים ספייק.
- תצוגת המסך ניתן לשנות את הפוטנציאל בתחום מקומיות (LFPs) בשביל להסתכל על localizing מקור מתפרצת פעילות. זה סוג של הגדרה יכול להיות שימושי יותר בעת ההקלטה in vivo מאז תרבויות monolayer יש LFPs חלש. ראוי לציין, כמה preamplifiers (כולל אחד אנו משתמשים מן Multi-Channel Systems) יש גבוהה לעבור מסננים ב 10 הרץ אשר להחליש התחתון LFP מקצבים תדר.
פ רשתות נוירונים מגרה על MEAs
- כך גם 59 אלקטרודות הקלטה על MEA יכול גם להיות מנוצל עבור מגרה את התרבות. אופי הניסוי תקבע את מידת הגירוי. NeuroRighter מספק גמישות לעיצוב הגירוי הניסיוני שכן הוא קוד פתוח. 15
- האתגר עם מגרה תרבות היא הגירוי יוצר חפץ שיכולה להימשך כמה אלפיות השנייה. ממצא זה יכול להיות גדול מספיק כדי לעורר גילוי ספייק ותגובות גירוי מעורפל. NeuroRighter מנצל את האלגוריתם SALPA לצמצום ובמקרים מסוימים למעשה ביטול חפץ גירוי. 19
- כדי לגרות את רשת נוירונים על MEA, הרכבת אלגוריתם SALPA תחת הכרטיסייה 'הגדרות הקלטה "כדי להגביל את החפץ גירוי. הפעל SALPA בכרטיסייה 'הגדרות' באינטרנט ". בחרו שם קובץ לחץ על לחצן התחל כמו בעבר כדי להתחיל את ההקלטה. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה 'סטים'. ישנן אפשרויות רבות להגדרת גירוי בדף זה.
- ניסוי פשוט היא לעורר one אלקטרודה ולראות את התגובה של המנה שימוש בסעיף "לולאה פתח". בחר את קצב מתח, שלב רוחב מספר הערוץ. לחץ על כפתור התחל בסעיף לולאה פתוחה. התגובות לגירוי זה ניתן דמיינו בכרטיסייה העיקרי "Spikes" ואת הכרטיסייה 'Spk Wfms "וניתח את קבצי הנתונים.
- בזמן אמת, התפרצויות ניתן דמיינו באופן זמן נעול לגירוי אחד הרץ של 0.5V על פני אלקטרודות מרובים. תרשים 2 מציג עלילה סריקה של תגובה פוסט לגירוי. לפני תצפיות הראו כי ישנם שני סוגים שונים של פעילות גירוי מעורר:. הפוטנציאלים לפעולה עורר ישירות (dAPs) פוטנציאל פעולה עורר synaptically (SAPs) 20
- נוירונים בתרבית יש התפרצויות של פעילות ספונטנית. בניסויים מסוימים, זה סוג של התפוצצות יכול להפריע מנסה לשלוט על הדינמיקה של הרשת. מעניין, מופץ גירוי בבית 1-2 הרץ לכל אלקטרודה יכול להתחיל מתפרצת לדכא פעילות ברשת עצבית על MEA. 21
ג בעיות הירי הקלטה מ MEAs
- אין פעולה פוטנציאלים או בהווה מתפרצת של MEA כאשר התוכנה מופעלת:
- האם התרבות מספיק מבוגר? פוטנציאל פעולה צריך להיות גלוי לקראת סוף השבוע הראשון במבחנה. מתפוצצים מתרחשת סביב 2-3 שבועות במבחנה.
- האם החומרה מקבל חשמל? מערכת NeuroRighter מנצל שני 6V מצברי עופרת חומצה לשלטון החומרה. מתג ההפעלה צריך להיות בעמדה הלאה את הסוללות טעון.
- האם התרבות בחיים? לפעמים זה יכול להיות מאתגר לקבוע במיוחד בתרבות צפוף ומעלה בגלל צמיחת יתר של תא גליה. עם זאת, אפשר לחפש נוירונים המופיעים בריא (מבריק, גופים אליפטי תא בצורת תחת מיקרוסקופ לעומת שלב) ושלמה (לא מפוצלת) תהליכים בתא. כמו כן יכול להיות בעיה עם התרבות אם יש ראיות לזיהום גלוי או במהירות בינונית משפיל (הופכים חומציים רק לאחר 1-2 ימים בין השינויים בינוני).
- מהי עכבה אלקטרודה? במהלך שימושים מרובים, מיקרו אלקטרודות או בידוד של MEA יכול להשפיל. NeuroRighter יש לו את היכולת להעריך את העכבה האלקטרודה. 15 קריאות עכבה רגילה סביב 1KHz צריך לנוע בין 10,000 ו 100,000 אום. עכבות גבוהה מציע מוביל שבור או אלקטרודות קריאות פחות מ -10,000 אום מציע בידוד דולף.
- האם מגבר קדם מחובר ללוח חומרה? מגבר קדם צריך כבל פלט המתחבר ללוח חומרה. מגבר קדם יש גם 4 לוחות ממריץ קטנים גם להתחבר הלוח חומרה הראשי חשובים גירוי בלבד.
- האם את הגדרות התוכנה NeuroRighter השתנה? תצורת החומרה הגדרות בתוכנה חייב להיות נכון עבור הקלטת לעבוד. התקנת גרסאות מעודכנות ועל מספר המשתמשים לשנות את ההגדרות זה יכול לגרום.
- האם MEA ב 35-37 מעלות צלזיוס? טמפרטורות למעבד יכול להוביל לירידה בפעילות ספונטנית ברשתות בקליפת המוח. זה בדרך כלל לא בעיה מאז הקלטת מתרחשת בתוך החממה אקלים מבוקר, אולם יש לאפשר איזון הטמפרטורה אם MEA כבר מחוץ בחממה במשך יותר מכמה שניות.
- האם המדיום השתנה בשעות האחרונות? ראינו תרבויות לעתים קרובות להפסיק את ירי במשך מספר שעות לאחר האכילה. לכן, הדרך הטובה ביותר היא לערוך ניסויים לפני האכלה.
- אלקטרודה עם להרוות רעש מוגזם רקע חלון הקלטה:
- האם להצמיד מגבר קדם במגע עם האלקטרודה על MEA מספיק? בעיה זו יכולה להיגרם על ידי סיכה misaligned על מכסה מגבר קדם, פיסה קטנה של אשפה, ירידה של המדיום, משטח אלקטרודה מושפל, או קרום ברור חופפים מן המכסה. בדיקת הקשר לבעיות אלה הוא הצעד הראשון. התאמת סיכה עם מקלון צמר גפן טבול אתנול 70% יכול לפעמים לשפר את הקשר במיוחד אם חלה ירידה של המדיום כי צריך לנקות משם. האות עשוי להופיע גרוע עד מתאדה אתנול. </ Li>
- האם האלקטרודה להיראות פגום? ויזואליזציה תחת מיקרוסקופ אור יכול לפעמים לגלות סדוקים או מגולענים בידוד אלקטרודה מוביל לסוג זה של חפץ.
- האם רפידות קשר שחוקים או שרוטים? לפעמים ייתכן שיש קשר אלקטרודה מספר על MEA שקשה לבצע אופטימיזציה. זה נפוץ יותר לאחר מספר שימושים MEA ו platings. חוט זהב ספוג spacer גומי מקיים רק בכיוון של עובי 0.5mm שלה יכול לשפר את הסיכה מגבר קדם קשר עם MEA. חומר זה זמין Fujipoly והוא יכול להיות חמוד כדי להתאים את MEA ואת המכסה.
- MEA שלמות מראה רעשי רקע יתר:
- האם MEA בכיוון הנכון כדי לאפשר את האלקטרודה הקרקע על MEA לפנות את הסיכה הקרקע על מגבר קדם? אם MEA הוא בכיוון הנכון אז הבטחת אין קשר הקרקע סוגיות (2 ac לעיל) חשוב גם לקחת בחשבון. האם ערוץ CR15 עם חוט הארקה קצר לתושבת קדם מגבר? באמצעות מגשר על הקרקע אותה דרך פנימית 30 נגדים kOhm עלול לגרום לרעש העולה.
- האם יש הפרעה האורות המקיפים, מקורות כוח או חלקים אחרים של ציוד? אחת הצורות הנפוצות ביותר של ההפרעה הוא 60 הרץ של אורות וציוד. מערכת ההקלטה חייבת להיות מעוגנת כראוי. כבלים חשופים מיגון גם יכול להיות מועיל להפחתת הפרעות רקע.
נציג תוצאות
באיור 1. זוהי מזימה סריקה של 2 דקות של פעילות ספונטנית מרשת עצבית. כל נקודה שחורה מייצג פוטנציאל פעולה. שני פרצי פעילות מצוינים עם החצים הכחולים. התגובה על אלקטרודות מרובים היא פונקציה של קישוריות לרשת.
איור 2. הנה העלילה סריקה של 16 שניות של פעילות גירוי מעורר. כוכבים אדומים מייצגים גירויים. החיצים האדומים המציגים חמישה גירויים כי המושרה בהצלחה פרצי פעילות סינפטית פני אלקטרודות מרובים. לעיתים, גירוי אינו תשואה פרץ, פה החץ הכחול.
Discussion
פרוטוקול זה מציג הנחיות כיצד לשמור על תרבות רשתות נוירונים על אלקטרודות מיקרו מערכים כמו גם היכרות עם הקלטה מ ומגרה רשתות נוירונים. חלק מהבעיות הנפוצות יותר כאשר הקלטה של MEAs נדונו גם בסעיף MEA בעיות. ישנן וריאציות מזדמנים בפרוטוקול כפי שנדונו במהלך ולעיתים קרובות שינויים אלה מנוצלים כדי לייעל את התנאים הספציפיים הנדרשים על ידי עיצובים ניסיוניים מסוימים.
למרות הקלטה מערכת מגרה המובא כאן מורכב מנהג שלנו נועד NeuroRighter 15 עם preamp MCS, ישנם מספר רב של מערכות אחרות שיכולות לספק ממשק עם רשתות נוירונים. בחירת ההתקנה מסוים יהיה תלוי על הצרכים הספציפיים ניסיוני.
הקלטה פשטני ודוגמאות גירוי נמסרו בפרוטוקול זה אולם אלה תרבויות על MEAs יכול לשמש כדי לספק תובנה שאלות מורכבות לגבי הפעילות הסינפטית וקישוריות רשת נוירונים. כאמור, העבודה השוטפת היא ניצול בטכנולוגיה זו כדי ללמוד תהליכים כמו פלסטיות הסלולר, פיתוח excitotoxicity ו ניוון מוחיים. 6-10 לדוגמה, פרסום האחרונות במעבדה שלנו הראה המטרה לשחזור מכוון למידה במבחנה עם גירוי בזמן אמת לולאה סגורה בתגובה לפעילות השוטפת רשת נוירונים 3.
למרות תרבויות MEA לעיתים קרובות בררנית ועדין, בזכות הפשטות והנגישות שלהם (לעומת בעלי חיים שלמים), הם מספקים מודל רב עוצמה ללימוד הפעילות העצבית ברמת הרשת.
Disclosures
CMH אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לחברי הקבוצה פוטר למתן הערות שלא יסולא בפז על פרוטוקול. עבודה זו מומנה על ידי מלגה הכשרה קלינית מחקר מן האקדמיה האמריקאית לנוירולוגיה קרן אל CMH, מלגה מן המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS; http://www.nigms.nih.gov/ ) כדי היודנראט (GM08169 ), מענק מ-NIH המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NS054809), ל 'רות Kirschstein השירות הלאומי לחקר פרס על היודנראט (NS060392), EFRI NSF מענק (0,836,017), פרס קרן קולטר Translational מחקר, וכן מלגת מחקר translational אל היודנראט (NS007480).
Materials
Supplies
Equipment:
Solutions and Reagents: BSA solution: Cell Medium: Dissection solution for preparing papain solution:23
This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Hank’s balanced salt solution: Hibernate solution: Laminin solution: Papain solution:23 Polyethyleneimine (PEI) solution:13 Sterile de-ionized water: Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).
- Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task. J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).
- Shahaf, G., Marom, S. Learning in networks of cortical neurons. J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).
- Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).
- Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).
- Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks. Phys Biol. 4, 181-193 (2007).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. Network plasticity in cortical assemblies. Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).
- Hofmann, F., Bading, H. Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration. J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).
- Gortz, P. Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations. J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).
- Koito, H., Li, J. Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies. J Vis Exp. 31, (2009).
- Brewer, G. J., Cotman, C. W. Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen. Brain Res. 494, 65-74 (1989).
- Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates. J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).
- Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy. Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).
- Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts. Front Neuroengineering. 2, (2009).
- Wagenaar, D. A., Potter, S. M. A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control. J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neurosci. 7, (2006).
- Wagenaar, D. A., Potter, S. M. Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting. J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).
- Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks. PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
- Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons. Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).
