Come la cultura, record e stimolare reti neuronali sulla micro-array di elettrodi (MEA)

Summary

Questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per l'impostazione, la cura, la registrazione e stimolando elettricamente culture su MEA.

Abstract

Per tutto il secolo scorso, i neuroscienziati di tutto il mondo hanno dedicato la loro vita per comprendere come le reti neurali funzionano e perché smettere di lavorare in varie malattie. Gli studi hanno incluso l'osservazione neuropatologici, la microscopia a fluorescenza con etichettatura genetica, e la registrazione intracellulare nei neuroni sia dissociato e preparati fetta. Questo protocollo descrive un'altra tecnologia, che coinvolge sempre più dissociato culture neuronali su micro-array di elettrodi (detti anche multi-array di elettrodi, MEA).

Ci sono molteplici vantaggi di utilizzare questo sistema rispetto ad altre tecnologie. Dissociato culture neuronali su tali accordi forniscono un modello semplificato, in cui l'attività di rete può essere manipolato con sequenze di stimolazione elettrica attraverso elettrodi multipli dell'array. Perché la rete è piccola, l'effetto della stimolazione è limitata ad aree osservabile, che non è il caso di preparati intatto. Le cellule crescono in un monostrato apportare modifiche nella morfologia facile da monitorare con varie tecniche di imaging. Infine, le culture su MEA può sopravvivere per oltre un anno in vitro che rimuove le limitazioni di tempo chiaro inerenti alle tecniche di coltura di altri ^1.

Il nostro laboratorio e altri in tutto il mondo stanno utilizzando questa tecnologia di porre domande importanti su reti neuronali. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire le informazioni necessarie per l'impostazione, la cura, la registrazione e stimolando elettricamente culture in AAM. Nelle reti in vitro forniscono un mezzo per porre fisiologicamente questioni rilevanti a livello di rete e livello cellulare che porta ad una migliore comprensione di funzione e disfunzione cerebrale.

Protocol

A. Introduzione

Ci sono miliardi di neuroni nel cervello umano. Ognuno di questi neuroni può avere centinaia di migliaia di connessioni spesso con molte celle diverse. Queste connessioni porto i segnali che ci permettono di camminare, giocare un pianoforte, andare in bicicletta, ridere, piangere e ricordare. Per tutto il secolo scorso, i neuroscienziati di tutto il mondo hanno dedicato la loro vita per comprendere come le reti neurali funzionano e perché smettere di lavorare in varie malattie.

Ci sono molti strumenti si può utilizzare quando si assume questo compito apparentemente insormontabili. Gli studi iniziali erano concentrati sull'osservazione neuropatologici di come sono organizzati i circuiti neurali nel cervello degli esseri umani e altri animali. L'avvento della microscopia a fluorescenza ed etichettatura genetica ampliato la portata di questi studi strutturali esplorare composizione cellulare fino al livello di proteine ​​e DNA.

Ma questi esperimenti non ha affrontato la funzione dinamica del cervello, ma solo la sistemazione statica. Per comprendere in corso l'attività neurale, tecniche popolare in genere si concentrano sull'esame attività elettrofisiologica con registrazione intracellulare. Singoli neuroni di culture dissociato forniscono un utile modello riduzionista, tuttavia questa tecnica è limitata da brevi intervalli di tempo per la registrazione da singole cellule. Questo modello fornisce anche informazioni limitate sulle altre cellule nella rete. Fettine di cervello di roditori forniscono più di un modello realistico in cui viene mantenuto l'architettura corticale. Ma fette tale, anche quando colti, hanno una durata limitata e può essere tecnicamente difficile da mantenere viva, pur mantenendo citoarchitettura ^2.

Un'altra tecnologia coinvolge sempre più le culture neuronali dissociate su micro-array di elettrodi (detti anche multi-array di elettrodi, MEA). I neuroni sono placcati su MEA che hanno microelettrodi integrati nel fondo del piatto. Nel corso di tre settimane, queste culture formano reti di neuroni completa di assoni, dendriti e centinaia se non migliaia di connessioni sinaptiche. Ci sono molteplici vantaggi di utilizzare questo sistema rispetto ad altre tecnologie. Dissociato culture neuronali su tali accordi forniscono un modello semplificato con cui lavoro (dell'ordine di una singola colonna corticale piuttosto che un cervello intatto). Le cellule crescono in un monostrato apportare modifiche nella morfologia facile da monitorare con varie tecniche di imaging. Attività di rete può essere manipolato con sequenze di stimolazione elettrica attraverso elettrodi multipli dell'array. Perché la rete è piccola, l'effetto della stimolazione è limitata ad aree osservabile, che non è il caso di preparati intatto. Infine, le culture su MEA può sopravvivere per oltre un anno in vitro che rimuove le limitazioni di tempo chiaro inerenti alle tecniche di coltura di altri. ¹ Perciò, le culture su MEA rappresentano un modello ideale per lo studio della connettività neuronale.

Il nostro laboratorio e altri in tutto il mondo stanno utilizzando questa tecnologia di porre domande importanti su reti neuronali. Attuali processi neuronali allo studio di questo modello sono le dinamiche di rete, sviluppo, apprendimento e memoria, plasticità sinaptica, eccitotossicità, ischemia e neurodegenerazione. ^3-10 I risultati di questi studi potrebbero avere implicazioni significative per stabilire migliori trattamenti per le malattie umane come malformazioni congenite, epilessia , ictus e morbo di Alzheimer. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire le informazioni necessarie per l'impostazione, la cura, la registrazione da culture e stimolante su MEA. L'obiettivo finale è quello di fornire un mezzo per i ricercatori di porre domande fisiologicamente rilevanti a livello cellulare e di rete che può forse portare ad una migliore comprensione della funzione cerebrale e la disfunzione e, infine, il trattamento di malattie che colpiscono i nostri neuroni e come comunicano.

Il seguente protocollo rappresenta oltre 10 anni di esperienza del nostro laboratorio in coltura, la registrazione e stimolante da reti neuronali su micro-array di elettrodi. Ogni passo è stato ottimizzato in modo da portare allo sviluppo di lunga sopravvivenza sana reti neuronali. I riferimenti sono erogate, se disponibili, mentre alcune impostazioni ottimali abbiamo determinato empiricamente. Prima di iniziare il protocollo, ottenere attrezzature e forniture e preparare soluzioni elencati nella sezione intitolata 'Materiali.' La sezione su 'La dissezione del cervello' sarà brevemente discusso, ma non dimostrato nel video di accompagnamento Gazzetta altri articoli Esperimento Visualizzato coprirà questo argomento ^11.

B. La dissezione del cervello

1. Cervelli interi sono estratti da embrioni ratti giorno 18 (E18). Ratti femmine gravide cronometrate sono anestetizzati con isoflurano per via inalatoria e decapitato. Gli embrioni vengono rimossi e sezionati secondo Guid il Consiglio Nazionale delle Ricerchee per la cura e l'uso di animali da laboratorio utilizzando un protocollo approvato dalla Emory University IACUC.
2. Mentre utilizzando una tecnica asettica, il cervello embrionale vengono rimossi e messi in soluzione equilibrata freddo Hank Sali (HBSS) in un piatto da 100 millimetri Petri sterile. Il resto del protocollo di dissezione si verifica in un microscopio da dissezione in una cappa a flusso laminare per minimizzare il rischio di contaminazione.
3. Il cervello dei topi vengono trasferiti uno alla volta per una seconda piastra di Petri sterile con HBSS per la dissezione. Mentre immersi in HBSS, l', talamo tronco cerebrale e del cervelletto sono tagliati fuori e gli emisferi sono attraversati.
4. Il tubercolo olfattivo viene utilizzato come una maniglia per assicurare l'emisfero, mentre rimuovendo delicatamente le meningi.
5. La corteccia è poi staccato dal sottostante ippocampo e striato e conservati in un tubo sterile 15 ml di soluzione di ibernazione su ghiaccio. ¹² Poiché ci sono più embrioni di solito, questa procedura viene poi ripetuta a seconda del numero desiderato di MEA di essere placcato e la densità cellulare desiderato. Cortecce sono combinati per il processo di dissociazione delle cellule come descritto di seguito. Cortecce può essere conservato a 4 ° C in soluzione di ibernazione fino a 24 ore prima della dissociazione con solo una minima perdita di vitalità cellulare. In alternativa al tessuto utilizzando sezionato in-house, tessuto cerebrale può essere sezionato acquistare da Bit Cervello ( www.brainbitsllc.com ).

C. MEA preparazione e corticale dissociazione

1. Il MEA sono ottenuti da ALA scientifico ( www.alascience.com ), un fornitore per il produttore, sistemi multi-canale. Ci sono diverse configurazioni per la MEA con variazioni di orientamento degli elettrodi e la spaziatura, presenza o assenza di un elettrodo di terra interna, presenza o assenza di un anello di vetro, e le dimensioni dell'anello in vetro. Per i nostri esperimenti di base che utilizziamo lo standard micro-elettrodi array contenente 60 elettrodi in un 8 per 8 disposizione a griglia con un anello di vetro. Il nitruro di titanio del diametro dell'elettrodo è di 30 micron e la distanza tra i centri elettrodo è di 200 micron. Uno degli elettrodi è più grande e funziona come il terreno o elettrodo di riferimento interno. Quando si maneggiano MEA, è di vitale importanza che nessun oggetto solido (ad esempio, puntali, fazzoletti di carta, o poliziotti gomma) mai toccare l'interno del piatto come questo può danneggiare gli elettrodi. Informazioni più dettagliate su MEA e la gestione possono essere trovati nel manuale utente MEA ( www.multichannelsystems.com / prodotti, mea / microelettrodo-arrays.html ).
2. La sera prima della preparazione delle cellule, la MEA vengono sciacquati con acqua deionizzata e poi lasciato a macerare in etanolo al 70% per 15 minuti. I piatti vengono poi poste in una cappa a flusso laminare con la luce UV per tutta la notte. Ai fini della gestione, ogni MEA è collocato in un piatto standard 100 polistirolo sterile Petri mm con date ed etichettatura messo sul piatto di Petri. Da segnalare, tra le altre tecniche di sterilizzazione in autoclave e utilizzando acqua a 90 ° C sono menzionati nel manuale di MEA utenti. Tuttavia, abbiamo scoperto che empiricamente autoclave sembra diminuire il numero di volte che un MEA possono essere utilizzati. Se si riutilizza MEA che attualmente hanno culture, la materia organica deve essere rimosso. 300-400 ml di tripsina 0,25% in PBS è incubata nel MEA a 35-37 ° C per 20 minuti. Il MEA è risciacquata con acqua deionizzata e successivamente ispezionati con un microscopio ottico. Se la materia cellulare rimane ancora, il passo tripsina viene ripetuta fino pulito. Se il piatto è pulito, quindi procedere con la fase di sterilizzazione come sopra. In generale, MEA possono essere riutilizzati più volte con le cure appropriate.
3. Anche la sera prima della placcatura, i coperchi MEA sono preparati e sterilizzati in autoclave. I coperchi sono realizzati su misura, ma possono anche essere acquistati da ALA-scientifico. Sono realizzati in politetrafluoroetilene teflon e hanno una membrana trasparente (etilene-propilene fluorurati Teflon) si estendeva lungo la parte superiore. La membrana permette la diffusione dei gas, ma limita la diffusione di acqua in tal modo eliminando virtualmente la necessità di un ambiente umidificato e prevenire gli effetti deleteri di evaporazione e iperosmolarità ^1.
4. Una volta che la dissezione sopra sono complete, preparazione MEA è continuato mettendo 100 l di polietileneimmina (PEI) soluzione nel centro di ogni MEA. ¹³ Nelle nostre mani, la soluzione offre meno PEI raggruppamento di cellule nel MEA che usare polilisina. Il piatto è consentito di sedersi a temperatura ambiente nella cappa a flusso laminare per 30 minuti con il coperchio leggermente appoggiato sul MEA per evitare l'evaporazione. Come promemoria, qualsiasi lavoro con l'apertura MEA o tessuto cerebrale dovrebbe avvenire in uno standard cappuccio cultura cella di flusso laminare per minizare il rischio di contaminazione.
5. Il MEA è poi risciacquata 3 volte con 1-2 ml di sterile acqua deionizzata. L'ideale cappa a flusso laminare di set-up includerà un apparato aspiratore per la rimozione dei liquidi dai piatti. Un consiglio pipetta sterile 200μl può essere collegato al tubo aspiratore. Non toccare la superficie del MEA mentre aspirazione in quanto ciò potrebbe danneggiare gli elettrodi. Dopo l'ultimo risciacquo, la MEA si lascia asciugare per almeno 30 minuti nella cappa a flusso laminare.
6. Durante questo periodo di essiccazione, il processo di dissociazione neuronale viene avviato ponendo la corteccia in 2 ml di soluzione di papaina in un flacone da 15 ml sterile in plastica conico. ¹ 50 ml di DNAsi viene aggiunto alla miscela. Il flaconcino è inserito in un bagno d'acqua a 35-37 ° C ed incubate per circa 20 minuti. Battere delicatamente la soluzione ogni 5 minuti per mescolare facendo attenzione ad evitare di introdurre bolle. Le cortecce dovrebbe iniziare ad assumere un aspetto sfocato come i proventi digestione.
7. La soluzione di papaina viene poi accuratamente rimosso pipettando lasciando la corteccia nel flacone 15ml conica. 2 ml di medium delle cellule si aggiunge alla corteccia, ha permesso di incubare per 2-3 minuti e poi delicatamente rimosso. Questo per lavare ogni residuo di papaina, che sarà anche inibita dal siero nel mezzo. Un altro 2 ml di medium di cellule si aggiunge alla corteccia e questo campione viene poi agitazione orizzontale ad alta velocità per 5-10 secondi. Ci dovrebbe essere una soluzione nuvoloso al fondo del flaconcino da 15 ml conica e non pezzi di cervello rimanenti. In alternativa, triturazione con 1 ml di terreno di 3 volte utilizzando un P-1000 portatile pipetta può essere utilizzata per dissociare il tessuto. ¹ Per triturazione corretto, ogni colpo pipetta dovrebbe prendere un secondo.
8. La soluzione è quindi consentito di passare dolcemente attraverso un filtro sterile cellula 40μm per gravità. Aggiungere lentamente la soluzione cellula una goccia alla volta nel colino con un P-1000. A 35 millimetri piatto sterile Petri viene utilizzato per raccogliere la soluzione tesa cellula.
9. La sospensione cellulare viene quindi trasferito di nuovo ad un flaconcino da 15 ml e medie cella è aggiunto a un volume finale di 4,0 ml ^14.
10. 500 microlitri di un 5% w / v BSA viene poi accuratamente a strati sul fondo del flacone da 15 ml coniche con un P-1000. ¹⁴ In questo modo spostare la cella contenente la soluzione verso l'alto nel flacone.
11. La soluzione cella con BSA a strati sul fondo viene poi centrifugato per 6 minuti a 200 xg per rimuovere i detriti piccoli e il contenuto intracellulare potenzialmente tossici. ¹⁴
12. Durante la fase di centrifugazione delle cellule, la MEA sono valutati visivamente per assicurarsi che siano completamente asciutti. 20 l di soluzione laminina vengono poi accuratamente posizionato nel centro della MEA garantire che tutti gli elettrodi sono coperti. ¹ Evitare l'introduzione di bolle d'aria in questa soluzione dal momento che può portare a insufficiente preparazione della superficie dell'elettrodo. Se il MEA non è completamente asciutta, poi la goccia di laminina si diffonderà in tutto il piatto rendendo potenzialmente più difficile localizzare le cellule in modo adeguato nel corso degli elettrodi, quando placcatura. Questa fase è molto delicata e ha il potenziale per portare alla superficie danni MEA con mano malferma o decadenza dell'autorizzazione in attenzione.
13. I coperchi in teflon sono posti sul MEA a questo punto per evitare l'evaporazione della laminina. Il posizionamento del coperchio è anche delicata. Un coperchio deve essere posizionato o rimossa quando il MEA è su una superficie completamente piatta. In caso contrario, le forze più esercitata da una superficie irregolare può rompere il fondo di vetro dell'array rendendolo inutilizzabile. Il piatto viene poi messo in incubatrice per 20 minuti.
14. Mentre la laminina è vincolante per il piatto, i 15 ml fiala contenente le cellule viene rimosso dalla centrifuga e trasferito di nuovo alla cappa a flusso laminare. Il pellet deve essere visibile sul fondo della fiala. Il surnatante viene accuratamente rimosso con una pipetta di plastica sterile 5ml sierologici. Salva il surnatante nel caso in cui il processo di centrifugazione era incompleta. Il pellet viene quindi risospeso delicatamente sia da triturazione con un P-1000 o un vortice veloce in 300-500 ml di medium di cellule a seconda del rendimento atteso. 10 ml di sospensione cellulare viene rimosso e collocato su un emocitometro per determinare la concentrazione cellulare. Se il rendimento è basso, analizzare il supernatante al microscopio per determinare se la fase di centrifugazione è stata incompleta. Centrifugazione può essere necessario ripetere. Se il rendimento è alto, poi una diluizione può essere necessario per il conteggio più accurato. Placcatura densità cellulare può variare da 5.000 a 300.000 cellule per MEA. Calcolare una diluizione in modo che il numero desiderato di cellule per la placcatura è in un volume finale di microlitri 15-20. Usiamo tipicamente una concentrazione finale da 1000 a 3000 cellule per microlitri. Un paio di cortecce in genere di rendimento tra i 10 ei 15 milioni di cellule. Questo numero potrebbe essere leggermente inferiore se triturazione viene utilizzato.
15. A questo punto, tha laminina incubazione sulla MEA dovrebbe essere completa. Il coperchio Teflon è rimosso dalla MEA e la maggior parte della goccia laminina è vuoto aspirato o pipettati distanza. Poi 15-20 microlitri di sospensione cellulare desiderato è immediatamente pipettati sulla zona umida residua di laminina. Fare attenzione a evitare l'introduzione di bolle d'aria in questo piccolo volume di sospensione cellulare come bolle d'aria può impedire le cellule in modo uniforme che copre tutti gli elettrodi. Il coperchio è gentilmente sostituito e il MEA è accuratamente riposto in incubatrice per 30 minuti. Il piatto viene poi controllato al microscopio ottico per assicurare che le cellule hanno aderito e coprire tutti gli elettrodi. Se tutti gli elettrodi non sono coperti, poi più cellule possono essere aggiunti e il MEA è rimesso in incubatrice con coperchio per permettere a queste nuove cellule di aderire. Se un tubo di sospensione cellulare viene utilizzato più che pochi minuti dopo seduto indisturbato, assicurarsi di agitare delicatamente per risospendere le cellule risolta. Una volta che la copertura elettrodo si raggiunge un adeguato, allora il piatto viene lentamente invaso da 1 ml di caldo (35-37 ° C) delle cellule di media. Il coperchio in teflon viene sostituito e il piatto è rimesso in incubatrice. La cappa a flusso laminare può rapidamente asciugare la laminina piccoli volumi e volumi di sospensione cellulare una volta sul MEA quindi aver cura di tenerli sigillati con i coperchi in teflon. L'ambiente ideale per l'incubatore sigillato MEA è del 5% di CO _2, 9% O ₂ e il 65% di umidità a 35-37 ° C. Bassa tensione di ossigeno è importante per la cultura a lungo termine, riducendo il danno ossidativo. ¹² Mantenere l'umidità del 65% riduce l'evaporazione attraverso la membrana di teflon (rispetto a nessun controllo dell'umidità) e permette MEA elettronica che può essere utilizzato in incubatrice senza danni causati dalla condensa di acqua (come con un normale incubatore umidificato alla saturazione).

D. Modifica medio delle cellule e la cura per le culture dissociato su MEA

1. Il giorno dopo la placcatura cellulare, ispezionare il MEA sotto il microscopio ottico. Se il colore del mezzo è ancora a pesca di colore rosso e vi è una quantità limitata di detriti cellulari e la morte cellulare, poi il cambio medio prima può essere ritardato per un altro giorno. Tuttavia, se il mezzo sta cominciando ad apparire più arancione o giallo e / o vi è una grande quantità di detriti cellulari e la morte cellulare, quindi cambiare mezzo. Tutte le modifiche di media dovrebbe avvenire in un normale cappuccio cultura cella di flusso laminare.
2. Il cambiamento medio prima consiste nel togliere il coperchio MEA, aspirando via tutti i media nel piatto, sostituendo la quantità rimossa con media cellula fresca, e poi sostituendo il coperchio. Sostituire l'intero importo del mezzo cellulare sul cambiamento primo mezzo per rimuovere eventuali residui restanti cellulari dal processo di placcatura. Successive modifiche medio dovrebbe aspirare via circa la metà del mezzo seguita, sostituendo la quantità rimossa con un mezzo fresco. Questo permette ad alcuni dei fattori di crescita che sono stati secreto nel mezzo delle cellule di rimanere con le cellule mantenimento di un ambiente più ottimale in crescita. Se la parte inferiore del coperchio è contaminato durante il processo di cambiamento medio o se il coperchio mostra segni di danneggiamento o adattamento sciolto, poi utilizzare un nuovo coperchio autoclave. Medio delle cellule possono essere memorizzati in incubatrice in un contenitore sterile con un coperchio personalizzati modificato (che ha una (etilene-propilene fluorurati) Teflon membrana per consentire lo scambio gassoso). Medio delle cellule possono anche essere conservato a 4 ° C, ma caldo ed equilibrare questo nell'incubatore prima media che cambia.
3. Rimuovere e sostituire circa la metà del mezzo in un piatto circa due volte a settimana. Alcune preparazioni cellulari può portare a cambiamenti di colore più rapidi nel terreno provocando la necessità di cambi più frequenti. Se il mezzo è nota per essere giallo, quindi modificare l'intero importo del mezzo. Rapida transizione al giallo può anche essere il segno della contaminazione così ispezionare il piatto sotto il microscopio ottico per segni visivi di infezione.
4. A seconda delle condizioni di sperimentazione e tecnica sterile, le culture che sono stati attentamente curati possono sopravvivere per più di un anno ^1.

Registrazione E. da MEA

1. Ogni MEA ha 59 elettrodi di registrazione e un elettrodo di terra interno. Ci sono diversi sistemi di registrazione commerciale, disponibili così come le versioni fatte su misura. Fornitori includono sistemi multi-canale, Tucker Technologies Davis, Axion Biosystems, Alpha Med scientifico MED64, Plexon, Ayanda Biosystems e biologici. Il nostro laboratorio utilizza attualmente una configurazione commerciale di Multi-Channel Systems, progettato sistema basato su Windows chiamato NeuroRighter ^15, e un costume disegnato sistema basato Linux chiamato MeaBench ^16. Ognuno di questi sistemi è in grado di registrare da MEA (Multi-Channel Systems) con un Multi-Channel preamplificatore Systems. Una configurazione commerciale da Tucker Technologies Davis è anche in uso. Questo protocollo dimostrerà la registrazione da MEA con NeuroRighter. NeIl software uroRighter è open-source e disponibile per il download gratuito insieme con i disegni hardware NeuroRighter gruppi di Google. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
2. Culture tra le MEA prendere 2-3 settimane per raggiungere uno stato stazionario di attività. ^17,18 Questa attività include potenziali d'azione spontanea e la cultura a livello di rottura (una raffica di potenziali d'azione che si diffonde sinapticamente attraverso una cultura). La natura di questo esperimento però determinerà il numero ideale di giorni in vitro prima di registrare.
3. Attività neuronale dipende dalle condizioni ambientali ideali tra cui la temperatura e pH. ¹ Come risultato, la nostra registrazione avviene nell'incubatrice come descritto sopra. Se gli esperimenti di breve durata (<30 minuti) sono stati progettati, c'è anche un modulo di riscaldamento disponibili in commercio che possono essere collegati al preamplificatore MCS per il mantenimento della temperatura ideale MEA.
4. Per avviare la registrazione, un MEA (ancora nella sua capsula di Petri) viene delicatamente trasferito dal termostato di stoccaggio per la registrazione incubatrice. Tenere il fondo del piatto parallelo al terreno. Evitare movimenti rapidi con la MEA o stridente il MEA come questi possono staccare la cultura dal substrato. Il MEA è poi rimosso dalla piastra Petri e collocati nella preamplificatore registrazione. Corrispondere l'elettrodo interno di terra nei piatti che stiamo dimostrando con l'elettrodo di terra sul preamplificatore (canale CR15 per il preamplificatore MCS). Pulire i contatti in tutto il perimetro del MEA utilizzando un tessuto o di cotone imbevuto di etanolo al 70% per rimuovere le impronte digitali o altri detriti che possono ostacolare una buona connessione. Dopo essersi assicurati che la MEA sia correttamente posizionato, il coperchio preamplificatore è allora abbassato e bloccato in posizione. I contatti sul coperchio preamplificatore debba essere fondato su cuscinetti di contatto l'elettrodo sulla MEA. Controllare visivamente l'allineamento contatto e regolare con un tampone di cotone, se necessario. Posizionare il preamplificatore sul dispositivo Peltier nell'incubatrice. Questo è composto da due lastre di rame con una pompa di calore termoelettrica Peltier inserita tra loro. Noi usiamo questo a circa 5 V, per rimuovere parte del calore prodotto dal circuito di preamplificazione. Questo impedisce la formazione di condensa sul lato interno del coperchio a membrana in Teflon. L'eventuale condensa potrebbe indicare un danno alla cultura di aumento dell'osmolarità del mezzo a contatto con le cellule, a causa dell'evaporazione. Garantendo che il preamplificatore e il mezzo sono uno o due gradi sotto la temperatura dell'incubatore d'aria, variazioni di osmolarità sono ridotti al minimo.
5. Accendere l'alimentazione NeuroRighter e aprire il software sulla workstation. NeuroRighter regolare le impostazioni in vitro con le appropriate configurazioni software / hardware anche sul posto. Selezionare il numero di elettrodi nel software. Al fine di ridurre la quantità di rumore di fondo, una digitale filtro passa-banda può essere abilitata. Selezionare un file di dati con l'interruttore di record, se i dati devono essere salvati per una successiva analisi. Attivare il pulsante di avvio una volta tutte le impostazioni appropriate scelte.
6. Lo schermo dovrebbe mostrare tracce in esecuzione di attività e di rumore di fondo. Potenziali d'azione occasionali e scoppia piatto gamma di attività dovrebbe essere visibile. La sezione in basso a registrare la risoluzione dei problemi da MEA discuteranno diversi problemi comuni se l'attività prevista non è visualizzata.
7. La visualizzazione a schermo può essere modificato per la determinazione di modalità di picco ('Spk WFMS' tab) in cui sono esposti i potenziali d'azione staticamente quali si presentano finestre temporali 3ms. Per un dato canale, vero e proprio potenziale d'azione extracellulare dovrebbe durare circa 1 ms e dovrebbe fuoco ripetutamente nella stessa direzione (positiva o negativa). A volte, due o più neuroni può essere visibile sull'elettrodo stesso con polarità diverse. Spikes con un corso breve periodo di tempo e polarità variabile sono artefatto probabile. La figura 1 mostra un grafico di dati raster picco.
8. La visualizzazione a schermo può essere modificato a potenziali di campo locale (LFPs) per uno sguardo a localizzare l'origine di scoppio attività. Questo tipo di impostazione può essere più utile quando si registra in vivo in quanto colture monostrato hanno LFPs debole. Da notare che alcuni preamplificatori (tra cui uno che usiamo da sistemi multi-canale) hanno filtri passa-alto a 10 Hz che si attenuano più bassi ritmi LFP frequenza.

F. Stimolare le reti neuronali su MEA

1. Lo stesso 59 elettrodi di registrazione su un MEA può essere utilizzato anche per stimolare la cultura. La natura di questo esperimento sarà determinare il grado di stimolazione. NeuroRighter fornisce la flessibilità per la progettazione stimolazione sperimentale dal momento che è codice open source ^15.
2. La sfida con stimolare una cultura è che lo stimolo di creare un artefatto che può durare diversi millisecondi. Questo artefatto può essere grande abbastanza per far scattare il rilevamento picco e le risposte stimolo oscuro. NeuroRighter utilizza l'algoritmo SALPA per ridurre al minimo e in alcuni casi eliminando sostanzialmente il manufatto stimolo ^19.
3. Per stimolare la rete neuronale del MEA, treno l'algoritmo SALPA sotto la scheda 'impostazioni di registrazione' di limitare l'artefatto stimolazione. SALPA attivare nella scheda 'Online Settings'. Selezionare un nome file e fare clic sul pulsante Start, come già per iniziare la registrazione. Quindi fare clic sulla scheda 'Stim'. Ci sono molte scelte per la creazione di stimolo in questa pagina.
4. Un semplice esperimento è quello di stimolare un elettrodo e guardare la reattività del piatto con la sezione 'anello aperto'. Selezionare l', il tasso di tensione, la larghezza di fase e numero di canale. Premere il pulsante di avvio nella sezione anello aperto. Le risposte a questo stimolo possono essere visualizzati su scheda principale 'Spikes' e la scheda 'Spk WFMS' e analizzato nei file di dati.
5. In tempo reale, esplosioni possono essere visualizzati in un tempo-locked modo ad uno stimolo un hertz di 0.5V attraverso elettrodi multipli. La Figura 2 mostra un grafico raster di un post-stimolo risposta. Osservazioni precedenti hanno dimostrato che ci sono due diversi tipi di stimolo-evocato attività:. Potenziali d'azione direttamente evocati (DAP) e potenziali d'azione evocati sinapticamente (SAP) ²⁰
6. Neuroni in cultura hanno scoppi spontanei di attività. Per alcuni esperimenti, questo tipo di scoppio possono interferire con il tentativo di controllare le dinamiche di rete. È interessante notare che la stimolazione distribuito a 1-2 Hz per elettrodi possono iniziare a reprimere attività di scoppiare in una rete neuronale in un MEA. ²¹

G. guasti registrazione da MEA

1. Nessun potenziale azione o presenti scoppio nel MEA quando il software è attivato:
   1. È la cultura abbastanza vecchio? Potenziali d'azione dovrebbe essere visibile verso la fine della prima settimana in vitro. Allo scoppio circa due o tre settimane in vitro.
   2. È l'hardware è alimentato? Il sistema utilizza due NeuroRighter 6V batterie al piombo per alimentare l'hardware. L'interruttore di alimentazione deve essere in posizione ON e le batterie cariche.
   3. È la cultura viva? A volte questo può essere difficile determinare in particolare nella cultura dense o più a causa della crescita eccessiva delle cellule gliali. Tuttavia, si può guardare per un sano i neuroni che appaiono (lucida, corpi cellulari di forma ellittica al microscopio a contrasto di fase) e intatti (non frammentati) processi cellulari. Ci può anche essere un problema con la cultura se non vi è evidenza di contaminazione visibile o rapidamente medio degradanti (diventando acida dopo solo 1-2 giorni tra cambiamenti media).
   4. Qual è l'impedenza degli elettrodi? Oltre molteplici usi, il micro-elettrodi o l'isolamento di un MEA può degradare. NeuroRighter ha la capacità di valutare l'impedenza degli elettrodi. Impedenza ¹⁵ letture normale attorno ad 1kHz deve essere compresa tra 10.000 e 100.000 Ohm. Superiore impedenze suggeriscono porta rotta o elettrodi e letture meno di 10.000 Ohm suggeriscono isolamento che perde.
   5. Il preamplificatore è collegato alla scheda hardware? Il preamplificatore dovrebbe avere un cavo di uscita che si collega alla scheda hardware. Il preamplificatore ha anche 4 schede stimolatore di piccole dimensioni che inoltre possibile collegare alla scheda hardware principali e sono importanti per la sola stimolazione.
   6. Sono le impostazioni del software NeuroRighter stato cambiato? Le impostazioni di configurazione hardware del software deve essere corretto per la registrazione al lavoro. L'installazione di versioni aggiornate e più cambiare le impostazioni degli utenti possono causare questo.
   7. È il MEA a 35-37 ° C? Le temperature più fredde può portare ad una riduzione dell'attività spontanea nelle reti corticali. Questo di solito non è un problema dato che la registrazione avviene in un clima controllato incubatore, tuttavia si deve permettere equilibrio temperatura se la MEA è stato al di fuori dell'incubatore per più di pochi secondi.
   8. È il medium stato modificato ultime ore? Abbiamo osservato le culture spesso smettere di sparare per diverse ore dopo il pasto. Pertanto, si consiglia di condurre esperimenti prima della poppata.
2. Elettrodo con la saturazione eccessivo rumore di fondo della finestra di registrazione:
   1. È il contatto pin preamplificatore con l'elettrodo sul sufficiente MEA? Questo problema può essere causato da un perno allineato sul coperchio preamplificatore, un piccolo pezzo di spazzatura, una goccia di medium, una superficie dell'elettrodo degradato, o di una membrana sovrapposizione chiaro dal coperchio. Ispezionare il contatto per questi problemi è il primo passo. Regolare il perno con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% possono a volte migliorare il contatto specialmente se ci fosse una goccia di medium che aveva bisogno di pulizia distanza. Il segnale può apparire peggio finché non evapora etanolo. </ Li>
   2. L'elettrodo sembra essere danneggiato? Visualizzazione al microscopio ottico a volte può rivelare rotto o snocciolate isolamento degli elettrodi che porta a questo tipo di artefatto.
   3. Sono le pastiglie contatto usurati o graffiato? A volte ci possono essere alcuni contatti degli elettrodi sulla MEA che sono difficili da ottimizzare. Questo è più comune dopo molteplici usi MEA e placcature. Un oro distanziale in gomma filo impregnato conduce solo nella direzione del suo spessore 0,5 mm e può migliorare pin di contatto con il preamplificatore MEA. Questo materiale è disponibile da Fujipoly e può essere carino per adattarsi al MEA e coperchio.
3. Tutto il MEA mostra eccessivo rumore di fondo:
   1. È il MEA con l'orientamento corretto in modo da consentire l'elettrodo di massa sulla MEA a contattare il pin di terra sul preamplificatore? Se il MEA è con l'orientamento corretto allora assicurando non ci sono problemi di contatto di terra (2 ac sopra) è anche importante considerare. È il canale CR15 a terra con un filo corto al telaio preamplificatore? Utilizzando il jumper a terra attraverso interno 30 resistenze kOhm può provocare rumore.
   2. C'è interferenze da luci circostanti, sorgenti di alimentazione o altri pezzi di equipaggiamento? Una delle più comuni forme di interferenza è di 60 Hz da luci ed attrezzature. Il sistema di registrazione deve essere messa a terra. Schermatura dei cavi a vista può essere utile anche a ridurre le interferenze di fondo.

Rappresentante Risultati

Figura 1. Si tratta di un complotto raster di 2 minuti di attività spontanea da una rete neuronale. Ogni puntino nero rappresenta un potenziale d'azione. Due esplosioni di attività sono indicati con le frecce blu. La risposta più elettrodi multipli è una funzione della connettività di rete.

Figura 2. Ecco una trama raster di 16 secondi di stimolo-evocato attività. Stelle rosse rappresentano stimoli. Le frecce rosse mostrano cinque stimoli che con successo ha indotto picchi di attività sinaptica attraverso elettrodi multipli. A volte, uno stimolo non produce uno scoppio, qui alla freccia blu.

Discussion

Questo protocollo mostra le istruzioni su come la cultura e mantenere reti neuronali su micro-array di elettrodi e come introduzione alla registrazione da reti neuronali e stimolante. Alcuni dei problemi più comuni quando si registra da MEA sono stati discussi anche nella sezione MEA risoluzione dei problemi. Ci sono variazioni occasionali nel protocollo come discusso in tutto e spesso questi cambiamenti sono utilizzati per ottimizzare le condizioni specifiche richieste da parte di alcuni progetti sperimentali.

Anche se il sistema di registrazione e stimolante qui presentata è composta della nostra progettato NeuroRighter ¹⁵ con il preamplificatore MCS, ci sono più altri sistemi in grado di fornire una interfaccia con le reti neuronali. La scelta di un particolare impostazione dipenderà dalle specifiche esigenze sperimentali.

Registrazione semplicistica e stimolazione esempi sono stati forniti in questo protocollo tuttavia queste culture su MEA possono essere utilizzati per fornire indicazioni su questioni complesse attività sinaptica e la connettività di rete neuronale. Come accennato in precedenza, i lavori in corso sta utilizzando questa tecnologia per studiare processi come la plasticità cellulare, lo sviluppo, eccitotossicità e neurodegenerazione. ^6-10 Ad esempio, una recente pubblicazione dal nostro laboratorio hanno mostrato obiettivo riproducibile regia di apprendimento in vitro in tempo reale la stimolazione a circuito chiuso in risposta alle attuali attività di rete neuronale ^3.

Anche se le culture MEA sono spesso schizzinosi e delicati, grazie alla loro semplicità e accessibilità (rispetto agli animali intatti), forniscono un potente modello per studiare l'attività neuronale a livello di rete.

Materials

Supplies Disposable bottle top filter (150ml, 0.2μm pore size; Nalgene #565-0020) Embryonic day 18 timed-pregnant female rat Micr–lectrode arrays (see description in protocol, B1) Micr–lectrode array lids (see description in protocol, B3) Nylon cell strainer (40μm, BD Falcon, #352340) Polypropylene conical vials (sterile, 15ml) Polystyrene Petri dishes (sterile, 35mm and 100x15mm) Pipet tips (sterile, 20μl, 200μl and 1000μl) Serological pipets (5ml) Equipment: Biological safety cabinet/laminar flow hood Cell counter Centrifuge Container of ice Dissecting scissors and forceps (sterilized) Dissecting microscope in a laminar flow hood Handheld electric pipetman Hemacytometer Isofluorane and gas chamber Light microscope Handheld pipetman (P-20 (20μl), P-200 (200μl), P-1000 (1000μl)) MEA recording system (see description in protocol, D1) Rodent Guillotine Tri-gas incubator (see description in protocol, B15) Vacuum flask with aspirator attached in the hood Vortex Water bath (35-37°C) Solutions and Reagents: BSA solution: Make 5% BSA (Sigma A-9418) in phosphate buffered saline pH 7.4 and filtered at 0.2μm. This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. Cell Medium: Combine 90 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific 9024), 10 ml horse serum (Gibco 16050), 1ml sodium pyruvate (100mM, Gibco 11360), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35050), and insulin (final concentration 2.5 μg/ml, Sigma I-5500) then pass through a 0.2 μm filter.22 Warm and equilibrate the cell medium in the incubator prior to use. Dissection solution for preparing papain solution:23 Dissection solution (100ml stock) Combine in order, filter 0.22 μm and store at 4°C. Component Volume ml Final Concentration (mM) Double-distilled water 91.175 1 M MgCl2 0.58 5.8 mM 1 M CaCl2 0.025 0.25 mM 0.5 M HEPES 0.32 1.6 mM 0.5% Phenol red 0.2 (0.001%) 0.1 N NaOH 0.2 0.2 mM 2 M Na2SO4 4.5 90 mM 1 M K2SO4 3.0 30 mM 0.1 M Kynurenic acid 1.0 1 mM 5 mM APV 1.0 0.05 mM This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Invitrogen (#18047019). 50μl aliquots are flash frozen and stored at -80°C. An aliquot is thawed in the laminar flow hood prior to starting the cell dissociation process. Hank’s balanced salt solution: Sigma (#4891). A 1X solution is prepared in deionized water, sterile filtered at 0.2μm and stored at 4°C. Hibernate solution: Prepare on day of culturing. Combine 98 ml L-15 medium (Invitrogen 11415) with 2 ml B-27 supplement (50X, Invitrogen #17504) and filter at 0.2 μm. Laminin solution: Prepare on day of culturing. Dilute 20μl of laminin (1mg/ml, Sigma L-2020) in 980 μl cell medium for a final concentration of 0.02mg/ml. 20 μl aliquots of the laminin (1mg/ml) are stored at -80°C and thawed just prior to use. Thawing should occur on the bench top and not in the water bath as rapid thawing can sometimes lead to gelling of the laminin. Papain solution:23 Warm 10 ml of dissection solution (above) to 30-32°C. Add 200 units papain (Sigma P-4762) and 1.6 mg L-cysteine (Sigma C-7880). Adjust pH to 7.4 with about 14 μl of 0.1 N NaOH. Incubate for about 30 minutes until the solution clears, filter 0.2 μm, flash freeze with liquid nitrogen in 2 ml aliquots in 15 ml polypropylene sterile conical vials and store at -80°C. Thaw an aliquot at 35-37°C prior to starting protocol. Polyethyleneimine (PEI) solution:13 100 μl of PEI (50% w/v, Sigma P-3143) is diluted in 100 ml sodium borate buffer (0.1 M pH 8.4, Sigma B-9876) for a final concentration of 0.05% w/v. Sterile filter at 0.2 μm. This can be prepared in advance and stored at 4°C for months. Sterile de-ionized water: Autoclave and allow to cool to room temperature prior to use. Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): 1ml aliquots are flash frozen and stored at -80°C. Aliquots are thawed in the 35-37°C water bath prior to use.