Summary
이 프로토콜은 설정을 돌보는에서 녹음 및 전기 MEAs의 문화를 자극하기 위해 필요한 정보를 제공합니다.
Abstract
지난 세기, 전세계 많은 neuroscientists이의 연결을 네트워크가 작동 방법을 이해하기 위해 자신의 인생을 헌신하고 왜 그들은 각종 질병에서 일하고 중지합니다. 연구 neuropathological 관찰, 유전자 라벨과 형광 현미경, 그리고 dissociated 뉴런과 슬라이스 준비 모두에서 세포 녹음을 포함합니다. 이 프로토콜은 마이크로 전극 배열 (또한 다중 전극 배열, MEAs)에 dissociated의 연결 문화를 성장과 관련된 또 다른 기술을 설명합니다.
다른 기술을 통해이 시스템을 사용하는 여러 장점이 있습니다. MEAs에 Dissociated의 연결을 문화 네트워크 활동이 배열 다중 전극을 통해 전기 자극을 시퀀스로 조절할 수있는 단순화된 모델을 제공합니다. 네트워크가 작은이기 때문에, 자극의 영향은 그대로 준비에 그런 경우가 아니라 관찰 지역으로 제한됩니다. 세포는 다양한 영상 기술을 모니터링하는 형태로 쉽게 변화를 만드는 monolayer 성장. 마지막으로, MEAs의 문화는 다른 culturing 기술과 본질적으로 어떤 명확한 시간 한계를 제거 체외에서 일년 이상 살아남을 수 있습니다. 1
전세계 우리의 실험실과 다른 사람의 연결 네트워크에 대한 중요한 질문을이 기술을 활용하고 있습니다. 이 프로토콜의 목적은, 돌보는, 설정에서 녹음 및 전기 MEAs의 문화를 자극하기 위해 필요한 정보를 제공하는 것입니다. 네트워크에서 생리학 관련 질문을과 더 나은 이해를 선도하는 세포 수준의 수단을 제공 체외 네트워크에서 두뇌 기능과 장애.
Protocol
A. 소개
인간 두뇌의 뉴런 수십억이 있습니다. 이러한 뉴런의 각는 다양한 세포와 수백 연결의 수천 자주 시간을 가질 수 있습니다. 이러한 연결은 우리가 도보 피아노, 자전거를 타고, 웃고, 울고, 그리고 기억하도록 신호를 항구. 지난 세기, 전세계 많은 neuroscientists이의 연결을 네트워크가 작동 방법을 이해하기 위해 자신의 인생을 헌신하고 왜 그들은 각종 질병에서 일하고 중지합니다.
이 겉보기 뛰어 넘을수없는 작업에 복용하면 하나가 사용할 수있는 다양한 도구가 있습니다. 초기 연구는 신경 회로가 인간과 다른 동물의 두뇌로 구성하는 방법의 neuropathological 관찰에 집중했다. 형광 현미경 및 유전 라벨의 도래는 단백질과 DNA 레벨로 세포 성분을 탐험 이러한 구조 연구의 범위를 확대했습니다.
그러나이 실험은 단지 정적 배열을 두뇌의 동적 기능을 주소하지 않았다. 지속적인 신경 활동을 이해하기위한 인기있는 기술은 일반적으로 세포 기록과 electrophysiological 활동을 검토하는 데 중점을 둡니다. dissociated 문화의 단일 뉴런 그러나이 기법은 단일 세포에서 레코딩을위한 짧은 시간 간격에 의해 제한됩니다 유용한 reductionist 모델을 제공합니다. 이 모델은 또한 네트워크에있는 다른 세포에 대한 제한된 정보를 제공합니다. 설치류의 뇌 조각 대뇌 피질의 구조가 유지되는 현실 모델의 자세한 내용을 제공합니다. 그러나 이러한 조각은 교양 경우에도, 제한된 수명을 가지고 cytoarchitecture 2 유지하면서 살리기 위해 기술적으로 도전하실 수 있습니다.
또 다른 기술은 마이크로 전극 배열 (또한 다중 전극 어레이, MEAs)에 성장 dissociated의 연결 문화를 포함합니다. 뉴런은 접시의 바닥에 microelectrodes 임베디드가 MEAs에 도금입니다. 3 주동안 과정 동안 이러한 문화 axons, dendrites 그리고 수백이 없다면 시냅스 연결의 수천 전체 뉴런의 네트워크를 형성하고 있습니다. 다른 기술을 통해이 시스템을 사용하는 여러 장점이 있습니다. MEAs에 Dissociated의 연결을 문화 일을있는 단순 모델 (단일 피질 컬럼의 순서보다는 손상 뇌)를 제공합니다. 세포는 다양한 영상 기술을 모니터링하는 형태로 쉽게 변화를 만드는 monolayer 성장. 네트워크 활동이 배열의 여러 전극을 통해 전기 자극을 시퀀스로 조작하실 수 있습니다. 네트워크가 작은이기 때문에, 자극의 영향은 그대로 준비에 그런 경우가 아니라 관찰 지역으로 제한됩니다. 마지막으로, MEAs의 문화가 다른 culturing 기술과 본질적으로 어떤 명확한 시간 한계를 제거 체외에서 일년 이상 살아남을 수 있습니다. 따라서 1, MEAs에 문화의 연결을 연결을 공부에 이상적인 모델을 나타냅니다.
전세계 우리의 실험실과 다른 사람의 연결 네트워크에 대한 중요한 질문을이 기술을 활용하고 있습니다. 이 모델과 함께 공부하고 현재의 연결 프로세스는 네트워크 역학, 개발, 학습과 기억, 시냅스 소성, excitotoxicity, 국소 빈혈 및 neurodegeneration를 포함합니다. 이러한 연구 3-10 연구 결과는 선천성 기형 같은 인간의 질병, 간질에 대한 더 나은 치료를 설립 중요한 영향을 할 수 , 뇌졸중과 알츠하이머 병. 이 프로토콜의 목적은의 기록과 MEAs의 문화를 자극에 대한 배려, 설정에 필요한 정보를 제공하는 것입니다. 궁극적인 목표는 연구자가 아마도 두뇌 기능과 장애에 대한 이해와 우리의 뉴런과 어떻게 의사 소통에 영향을 미칠 질병의 궁극적 치료를 초래할 수있는 휴대 전화 및 네트워크 수준에서 생리학 관련 질문을 할 수있는 수단을 제공하는 것입니다.
다음 프로토콜에서 레코딩과 마이크로 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극, culturing 우리의 실험실에서 경험 10 년 이상 나타냅니다. 장기 건강의 연결을 네트워크를 생존의 발전으로 이어질만큼 각 단계가 너무 최적화되었습니다. 일부 최적의 설정은 우리가 경험적으로 결정하는 동안 어디에 사용 가능한 참조를 제공합니다. 이전 프로토콜을 시작하기 위해, 장비 및 보급품을 얻고 섹션에 나열된로 솔루션을 준비 '자료. '뇌 해부'의 부분은 간략하게 설명하지만, 시각 실험 기사의 다른 저널로이 주제에 11 커버와 함께 비디오 시연되지 않습니다.
B.의 뇌 해부
- 전체 두뇌는 배아 일 18 일 (E18) 쥐에서 추출됩니다. 시간 초과 - 임신 여성 쥐가 흡입 isoflurane과 참수와 anesthetized 있습니다. 배아는 국가 연구위원회의 GUID에 따라 제거하고 해부하는 아르에모리 대학 IACUC 승인 프로토콜을 사용하는 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 전자.
- 무균 기술을 이용하지만, 배아 머리는 제거하고 100mm 멸균 배양 접시에있는 차가운 행크의 밸런스드 솔츠 용액 (HBSS)에 배치됩니다. 해부 프로토콜의 나머지 오염에 대한 위험을 최소화하기 위해 층류 후드의 해부 현미경으로 발생합니다.
- 쥐 머리가 절개를 위해 HBSS로 두 번째 멸균 페트리 접시에 한 번에 하나씩 전송됩니다. HBSS에 빠져들지만, brainstem, 시상과 소뇌는 버려야되고 반구가 bisected입니다.
- 후각 결절은 부드럽게 meninges를 제거하는 동안 북반구 보안을위한 처리로 활용됩니다.
- 일반적으로 여러 개의 배아가 있으므로 피질은 다음 기본 해마와 striatum 멀리 벗겨 얼음에 최대 절전 모드 솔루션의 살균 15 ML 원뿔 관에 저장. 12,이 절차는 다음 도금 수 MEAs의 원하는 수에 따라 반복됩니다 하고 원하는 세포 밀도. 아래에 설명되어로 Cortices은 세포 분리 과정 결합됩니다. Cortices 4에 저장될 수 있습니다 ° 최대 절전 모드 솔루션의 C 세포 생존만이 최소한의 손실로 24 시간 전에 해리까지를 위해. - 집안에서 해부를 활용하여 조직의 대안으로, 해부 뇌 조직은 뇌 비트 (에서 구입할 수 있습니다 www.brainbitsllc.com ).
C. MEA 준비와 피질 해리
- MEAs는 에이러 과학 (에서 얻을 수 있습니다 www.alascience.com ), 제조 업체, 멀티 채널 시스템을위한 공급 업체. 전극 방향과 간격, 존재 또는 부재 내부 접지 전극, 존재 또는 유리 반지의 부재, 그리고 유리 반지의 크기 변화와 MEAs 몇 가지 구성이 있습니다. 우리의 기본적인 실험을 위해 우리는 작은 유리 반지 8 그리드 배열하여 8에서 60 전극을 포함하는 표준 마이크로 전극 배열을 사용합니다. 티타늄 질화물 전극 직경 30 μm의 및 전극 센터 사이의 거리가 200 μm의입니다. 전극 중 하나는 지상 또는 내부 기준 전극으로 크고 기능입니다. MEAs을 처리하는 경우, 이것이 전극 손상을 수있는 어떤 고체 물질 (예, 피펫 팁, 종이 티슈, 또는 고무 경찰)도 접시의 내부를 건드리지 않을 것이 극히 중요합니다. MEAs 및 처리에 대한 자세한 정보는 MEA 사용자 설명서 (에서 찾을 수 있습니다 www.multichannelsystems.com / 제품 - 내 잘못 / microelectrode - arrays.html ).
- 이전 셀 준비에 저녁에, MEAs는 데 - 이온화 물로 씻어서 후 15 분 동안 70 %의 에탄올에 담그다 수 있습니다. 요리는 다음 하룻밤에 자외선과 층류 후드에 배치됩니다. 취급 목적을 위해, 각 MEA는 날짜와 페트리 접시에 배치 라벨과 표준 100mm 살균 폴리스티렌 페트리 접시에 배치됩니다. 음표의 90에서 물을 autoclaving 및 활용 등 다른 살균 기술 ° C MEA 사용자 설명서에 언급하고 있습니다. 그러나, 우리는 경험적으로 autoclaving는 MEA가 사용할 수있는 횟수를 줄일 것 것으로 나타났습니다. 현재 문화를 MEAs을 재사용하는 경우, 다음 유기물이 제거되어야합니다. PBS에 0.25 %의 트립신의 300-400 μl 20 분 동안 35-37 ° C의 MEA에 incubated입니다. MEA는 드 - 이온화된 물로 씻어서 그리고 가벼운 현미경으로 검사합니다. 세포 문제가 여전히 남아있을 경우 다음 트립신의 단계는 깨끗한 때까지 반복됩니다. 요리가 깨끗한있다면, 위와 같이 살균 단계로 진행하십시오. 일반적으로, MEAs은 적절한 치료와 함께 여러 번 재사 용할 수 있습니다.
- 또한 이전에 도금하는 저녁, MEA의 뚜껑을 준비하고 autoclaved 있습니다. 뚜껑이 만들어 사용자 정의 있지만 또한 에이러 - 사이 언티픽에서 구입하실 수 있습니다. 그들은 테플론 polytetrafluoroethylene의 만든 맑은 멤브레인 (플루오르 에틸렌 - 프로필렌 테플론) 가로질러 뻗어있다있다. 막이 가스의 확산을 허용하지만, 거의 humidified 분위기의 필요성을 제거하고 증발과 hyperosmolarity의 해로운 영향을 방지함으로써 물의 확산을 제한 1.
- 위의 해부가 완료되면, MEA 준비 각 MEA의 중심에 polyethyleneimine (PEI) 솔루션을 100 μl를 배치하여 계속합니다. 우리 손에 13, PEI 솔루션은 polylysine 사용하는 것보다 MEA의 세포의 적은 클러스터링을 제공합니다. 접시는 가볍게 증발을 방지하기 위해 MEAs에 휴식 뚜껑 30 분 동안 층류 후드에 실온에서 앉을 수있다. 거듭 말씀 드리지만, 오픈 MEA이나 뇌 조직과의 작업은 미니에 표준 세포 배양 층류 후드의 자리를 대신한다오염의 위험을 마이즈.
- MEA는 다음 멸균 드 이온화 물 1-2 ML 3 번 씻어서입니다. 이상적인 층류 후드 설정은 요리에서 액체를 제거 흡인기 장치가 포함됩니다. 무균 200μl 피펫 팁은 흡인기의 튜브에 첨부하실 수 있습니다. 이것은 전극 손상을 줄 수로 aspirating 동안 MEA의 표면을 만지지 마십시오. 린스 최종 후, MEA는 층류 후드에 적어도 30 분 동안 건조 수 있습니다.
- 이 건조 기간 동안의 연결을 분리 프로세스는 15 ML 살균 원뿔형 플라스틱 병에 papain 솔루션 2 ML에 cortices를 삽입하여 시작합니다. DNAse 1 50 μl가 혼합물에 추가됩니다. 유리병은 35-37 ° C에서 물 목욕으로 배치하고 약 20 분 동안 incubated입니다. 부드럽게 솔루션에게 거품을 도입하지 않도록주의하고 혼합을 위해 5 분마다 누릅니다. cortices은 소화의 진행으로 퍼지 모양에 걸릴하기 시작한다.
- papain 솔루션은 다음 조심스럽게 15ml 원뿔 유리병에 cortices 떠나 pipetting하여 제거됩니다. 세포 매체 2 ML은 cortices에 추가 2~3분에 대한 부화 허용하고 부드럽게 제거됩니다. 이것은 또한 매체의 혈청에 의해 저해됩니다 잔여 papain을 씻어 것입니다. 세포 매체의 다른 2ml는 cortices에 추가되고이 샘플은 다음 50-10초 높은 속도에 vortexed 있습니다. 15ml 원뿔 유리병의 바닥에 흐린 솔루션없이 나머지 뇌 조각이 있어야합니다. 또는, 3 배 중간 1 ML과 가루약은 P - 1000 휴대용 피펫을 사용하여이 조직을 dissociating 활용하실 수 있습니다. 적절한 분쇄의 경우 1, 각 피펫 스트로크 하나 잠시 소요됩니다.
- 솔루션은 다음 중력을 통해 살균 40μm 셀 스트레이너를 통해 부드럽게 통과할 수있다. 천천히 P - 1000와 여과기에 한 번에 셀 솔루션 한 방울을 추가합니다. 35mm 멸균 페트리 접시는 긴장 세포 솔루션을 수집하기 위해 사용된다.
- 세포 현탁액은 다음 15 ML 원뿔 유리병에 다시 전송하고 세포 매체는 4.0 ML의 최종 볼륨에 추가됩니다. 14
- 5 % W / V BSA 용액 500 μl 그런 다음 조심스럽게 P - 1000과 함께 15ml 원뿔 유리병의 바닥에 겹쳐있다. 14 이것은 약병에있는 세포가 포함된 솔루션 위쪽 치환됩니다.
- 바닥에 BSA 계층과 함께 셀 솔루션은 다음 작은 파편들이 잠재적으로 독성 세포 내용물을 제거 200 XG 6 분 centrifuged입니다. 14
- 세포 원심 분리 단계 동안 MEAs는 시각들이 완전히 건조되도록 평가하고 있습니다. laminin 솔루션 20 μl 그 다음 조심스럽게 전극 모두 적용되는 보장 MEA의 중앙에 배치됩니다. 1 그 전극 표면의 불충 분한 준비로 이어질 수 있기 때문에이 솔루션에 공기 방울을 도입하지 마십시오. MEA가 완전히 건조되지 않은 경우, 다음 laminin의 드롭 가능성이 도금 때 더 어려워 적절하게 전극을 통해 세포를 집중하기 위해 만드는 요리를 통해 확산됩니다. 이 단계는 매우 섬세하고 불안 정한 손으로 MEA 표면 손상으로 이어질 또는 관심에 경과시킬 잠재력이있다.
- 테플론 뚜껑은 laminin의 증발을 방지하기 위해이 시점에서 MEA에 게재됩니다. 뚜껑의 위치도 섬세하고 있습니다. MEA는 완전히 평평한 표면에있는 경우 덮개는 위치 또는 제거되어야합니다. 그렇지 않으면, 고르지 않은 표면에 의해 끼쳤다 추가 병력은 사용할 수 없게 렌더링 배열의 유리 바닥 균열 수 있습니다. 요리 그 다음 20 분 동안 인큐베이터에 배치됩니다.
- laminin이 접시에 바인딩되는 동안 세포를 포함하는 15 ML 원뿔 유리병은 원심에서 제거하고 층류 후드로 다시 전송됩니다. 펠렛은 유리병의 아래쪽에 표시됩니다. 뜨는은 신중하게 살균 5ml 플라스틱 serological 피펫과 함께 제거됩니다. 원심 분리 과정이 불완전 경우에 뜨는를 저장합니다. 펠렛은 다음 P - 1000 또는 예상 생산량에 따라 셀 매체 300-500 μl의 빠른 소용돌이로 분쇄하여 부드럽게 중 resuspended입니다. 세포 현탁액의 10 μl을 제거하고 세포 농도를 결정하는 hemacytometer에 위치합니다. 수율이 낮은 경우, 원심 분리 단계가 불완전 있는지 확인하기 위해 현미경으로 표면에 뜨는를 분석합니다. 반복 원심 분리가 필요할 수 있습니다. 수율이 높은 경우, 희석 더 정확한 계산을 위해 필요할 수 있습니다. 전지 도금 밀도는 5,000 MEA 당 300,000 셀 범위 수 있습니다. 도금에 대한 세포의 원하는 숫자가 15-20 μl의 최종 볼륨에되도록 희석을 계산합니다. 우리는 일반적으로 μl 당 1000-3000 세포의 최종 농도를 사용합니다. cortices 중 하나는 한 쌍의는 일반적으로 만 10 ~ 15 세포를 얻을 수 있습니다. 가루약을 활용하는 경우이 숫자는 약간 낮을 수 있습니다.
- 이 무렵, T그는 MEA에 부화가 완료되어야 laminin. 테플론 뚜껑은 MEA에서 제거하고 laminin 드롭의 대부분은 진공 aspirated 또는 거리 pipetted입니다. 그런 다음 원하는 세포 현탁액의 15-20 μl 즉시 laminin의 잔류 서부 유럽 표준시 지역에 pipetted입니다. 기포가 균일하게 전극을 모두 다루는로부터 세포를 방지할 수있는 세포 현탁액의 작은 볼륨에 공기 방울을 도입하지 않도록주의하십시오. 뚜껑이 부드럽게 교체 및 MEA는 신중하게 30 분 동안 인큐베이터에 다시 배치됩니다. 요리는 다음 세포가 준수했는지 확인하고 전극을 모두 커버하는 가벼운 현미경으로 검사합니다. 전극 모두 다루지 않는 경우, 그때 더 많은 전지가 추가될 수 있으며 MEA는 이러한 새로운 세포를 준수하도록에 뚜껑이있는 인큐베이터에 다시 배치됩니다. 세포 현탁액의 튜브가 그대로 앉아 후 몇 분 이상을 사용하는 경우, 결정된 세포를 resuspend을 부드럽게 소용돌이해야합니다. 일단 적절한 전극 범위는 다음 접시가 천천히 따뜻하게의 1ml (35-37 ° C) 세포 매체와 홍수입니다 이루어진다. 테플론 덮개 교체되고 요리가 인큐베이터에 다시 배치됩니다. 층류 후드 신속 때문에 테플론 뚜껑과 함께 그들 밀폐 유지하는데주의를 기울여야 한 번 MEA에있는 작은 laminin 볼륨 및 세포 현탁액 볼륨을 건조하실 수 있습니다. 밀봉된 MEAs에 대한 이상적인 보육 환경은 5 % 35-37에서 CO 2, 9퍼센트 O 2, 65 % 습도 ° C.입니다 낮은 산소 장력이 산화 손상을 감소, 장기 문화 것이 중요합니다. 12 유지 65 % 습도는 테플론 막 통해 증발을 감소 (NO 습도 조절에 비해)와 물 응축의 손상없이 MEA 전자는 인큐베이터에서 사용할 수 있습니다 (같은 채도에 humidified 정상 인큐베이터)과 함께.
D.는 세포 매체를 변경하고 MEAs에 dissociated 문화를 돌보는
- 전지 도금 다음날에 빛을 현미경으로 MEA를 검사합니다. 매체의 색상은 색상에 빨간색으로 계속 복숭아 있으며 휴대 파편과 세포 죽음을 제한 금액이있다면, 첫 번째 매체 변경은 다른 하루 지연될 수 있습니다. 매체가 더 오렌지이나 색상 및 / 노란색으로 표시 시작하거나 세포 파편 및 세포 사망의 대량이있다면 단, 다음, 매체를 변경합니다. 모든 매체 변화는 표준 세포 배양 층류 후드에서 발생한다.
- 첫 번째 중간 변화는 MEA의 뚜껑을 제거 접시에있는 매체의 모든 거리 aspirating, 신선한 세포 매체로 제거 금액을 대체하고, 다음 뚜껑을 교체로 구성되어 있습니다. 도금 과정에서 남아있는 세포 파편을 제거하는 최초의 매체 변화에 세포 매체의 전체 금액을 대체합니다. 이후 중간 변경 사항은 단 신선한 매체로 제거 금액을 대체하여 다음 매체의 절반 대기음해야합니다. 이것은 최적의 성장 환경을 유지하는 세포로 남아 셀 매체에 분비되어있는 성장 요인 중 일부를 수 있습니다. 뚜껑의 아래쪽은 중간 변화 과정에서 훼손이나 뚜껑이 손상되거나 느슨한 피팅의 징후를 보여주는 경우, 다음 새 autoclaved 뚜껑을 활용하는 경우. 세포 매체는 사용자 지정 수정 뚜껑이있는 멸균 용기 (기체 교환을 가능하도록하기 위해서 테플론 (에틸렌 - 프로필렌 플루오르) 멤브레인를 가지고)에서 인큐베이터에 저장할 수 있습니다. 세포 매체도 4 저장할 수 있습니다 ° C 있지만 따뜻하고 전에 변화 매체 배양기에서 이것을 평형.
- 제거하고 일주일에 두 번 약 접시에 매체의 약 절반을 교체하십시오. 일부 세포 준비가 더 자주 변경 필요를 일으키는 매체보다 빠른 색상의 변화가 발생할 수 있습니다. 매체가 노란색으로 언급되면 매체의 전체 금액을 변경합니다. 노란색으로 급속한 전환은 또한 오염의 서명 수 있으므로 감염의 영상 신호를 빛을 현미경으로 접시를 조사할 수있게된다.
- 실험 조건 및 살균 기술에 따라 신중하게 치료를했습니다 문화는 년 이상 생존할 수 1.
MEAs에서 E. 녹음
- 각 MEA 59 기록 전극 하나의 내부 접지 전극이 있습니다. 사용 가능한 여러 상용 녹음 시스템뿐만 아니라 사용자 정의 만든 버전이 있습니다. 업체들은 멀티 채널 시스템, 터커 데이비스 기술, Axion Biosystems, 알파 클럽메드 과학 MED64, Plexon, Ayanda Biosystems 및 생물학을 포함합니다. 우리 연구실은 현재 멀티 채널 시스템에서 상용 설치, NeuroRighter 15이라는 Windows 기반 시스템을 설계하는 사용자 정의하고, MeaBench 16라는 리눅스 기반 시스템을위한 사용자 정의를 사용합니다. 이러한 시스템의 각 멀티 채널 시스템 preamplifier를 사용하여 MEAs (멀티 채널 시스템)에서 레코드 수 있습니다. 터커 데이비스 기술의 상업적 설치 프로그램은 사용에 있습니다. 이 프로토콜은 NeuroRighter와 MEAs의 기록을 입증합니다. NEuroRighter 소프트웨어는 오픈 소스와 NeuroRighter Google 그룹에서 하드웨어 디자인과 함께 무료로 다운로드할 수 있습니다. ( http://sites.google.com/site/neurorighter/ )
- MEAs의 문화 활동의 안정 상태에 도달 2-3주 가져가라. 17,18이 활동 (문화 전체 synaptically 확산 실천 가능성의 공세) 파열 자연 실천 잠재력과 문화 전반을 포함합니다. 실험의 성격은 그러나 녹음하기 전에 체외에서 일 이상 번호를 결정합니다.
- 의 연결 활동이 온도와 산도를 포함하여 이상적인 환경 조건에 따라 달라집니다. 결과적으로 1, 우리의 기록은 위에서 설명한 배양기에서 이루어진다. 짧은 실험 (<30 분) 설계하는 경우에는 이상적인 MEA의 온도를 유지하기위한 MCS의 preamplifier에 연결된 수있는 상용 가열 모듈도있다.
- 녹음을 시작하려면, MEA는 (아직은 페트리 접시에) 부드럽게 저장 인큐베이터에서 녹음 인큐베이터로 전송됩니다. 바닥에 접시 병렬의 하단에 보관하십시오. 이들은 기판의 문화를 분리 수 MEA 또는 부조화 MEA와 빠른 움직임을 피하십시오. MEA는 다음 페트리 접시에서 제거하고 기록 preamplifier에 배치됩니다. 우리가 현재 preamplifier (MCS의 preamplifier에 대한 채널 CR15)에 접지 전극과 함께 시연하는 요리의 내부 접지 전극을 일치시킵니다. 면봉 좋은 연결을 방해 수도 지문 또는 기타 이물질을 제거하는 70 % 에탄올로 moistened 조직이나 면봉을 사용하여 MEA의 경계 주변의 연락처를 닦아주십시오. MEA가 올바르게 장착되어 있는지 확인한 후, preamplifier의 뚜껑은 다음 저하되고 제자리에 붙어. preamplifier의 뚜껑에있는 연락처는 MEA의 전극 접촉 패드에 단단히 휴식한다. 시각 연락처 정렬을 검사하고 필요한 경우 면봉로 조정합니다. 인큐베이터에있는 펠티어 소자에 preamp를 놓습니다. 이것은 그들 사이에 끼워 넣으면 펠티어 열전 열 펌프 두 개의 구리 플레이트로 구성되어 있습니다. 우리는 preamp 회로에 의해 생성되는 열을의 일부를 제거하는, 5V에 대해 이것을 실행합니다. 이것은 테플론 막 뚜껑의 안쪽에 형성에서 응축을 방지합니다. 모든 응축은 증발에 의한 세포에 접촉 매체의 osmolarity 증가하여 문화를 해를 나타내는 것입니다. 그 preamp와 매체 보육 공기 온도보다 낮은 학위 또는 두된다함으로써, osmolarity의 변화가 최소화됩니다.
- NeuroRighter에 전원 공급 장치의 전원을 켜고 워크 스테이션에 소프트웨어를 엽니다. 또한 장소에 적절한 소프트웨어 / 하드웨어 구성으로 체외에 NeuroRighter 설정을 조정합니다. 소프트웨어 전극의 개수를 선택합니다. 배경 잡음의 양을 줄이기 위해, 디지털 대역 통과 필터를 사용할 수 있습니다. 데이터를 나중에 분석을 위해 저장하는 경우에 기록 스위치와 데이터 파일을 선택합니다. 모든 적절한 설정이 선택되면 시작 버튼을 활성화합니다.
- 화면이 활동과 배경 잡음의 흔적을 실행하고 표시합니다. 가끔 작업 잠재력과 활동의 다양한 요리 없어지는가 표시되어야합니다. 예상 활동이 시각되지 않는 경우 문제 해결 MEAs의 기록에 아래의 섹션은 몇 가지 일반적인 문제에 대해 설명합니다.
- 화면보기들은 3ms 시간 창에서 발생하는 같은 행동 잠재력이 정적으로 표시되는 스파이크 탐지 모드 ( 'Spk Wfms'탭)을 변경할 수 있습니다. 주어진 채널에 대해, 실제 세포 액션 잠재력은 약 1ms 마지막 있어야하고 같은 방향으로 (긍정적이거나 부정적인)에 반복적으로 불이해야합니다. 때로는 두 개 이상의 뉴런이 서로 다른 극성과 같은 전극에서 볼 수 있습니다. 짧은 시간 코스와 변수 극성과 스파이크 가능성이 유물입니다. 그림 1은 스파이크 데이터의 래스터 음모를 보여줍니다.
- 화면보기는 활동을 파열의 기원을 번역 좀 봐 현지 필드 잠재력 (LFPs)로 변경할 수 있습니다. monolayer의 문화가 약한 LFPs을 갖고 있기 때문에 생체내에 녹음 할 때 설정이 유형의 더 유용할 수 있습니다. 음표의 일부 preamplifiers은 (우리가 멀티 채널 시스템에서 사용도 포함) 낮은 주파수 LFP의 리듬을 감쇠합니다 10 Hz에서 높은 통과 필터를했습니다.
MEAs에 F. 자극의 연결 네트워크
- MEA에서 같은 59 기록 전극도 문화를 자극 활용하실 수 있습니다. 실험의 자연은 자극의 범위를 결정합니다. 그것이 오픈 소스 코드이기 때문에 NeuroRighter은 자극 실험 설계를위한 유연성을 제공합니다. 15
- 문화를 자극과 도전이 자극이 몇 밀리초 마지막 수있는 유물을 만들어 것입니다. 이 유물은 스파이크 감지하고, 모호한 자극 응답을 실행할 수있을만큼 충분히 큰 수 있습니다. NeuroRighteR은 자극 유물을 최소화하고 경우에 따라 본질적으로 제거하고 SALPA 알고리즘을 사용합니다. 19
- MEA에의 연결을 네트워크를 자극하는, 자극의 유물을 제한하는 '녹음 설정'탭 아래의 SALPA 알고리즘을 훈련. '온라인 설정'탭에서 SALPA을 활성화합니다. 파일 이름을 선택하고 레코딩을 시작하려면 이전과 같이 시작 버튼을 클릭하십시오. 그런 다음 'Stim'탭을 클릭하십시오. 이 페이지에 자극을 설정하기위한 많은 선택이있다.
- 간단한 실험을 한 전극을 자극하고 '열기 루프'섹션을 사용하여 요리의 응답을 볼 수 있습니다. 속도, 전압, 위상 폭 및 채널 번호를 선택합니다. 열린 루프 섹션의 시작 버튼을 누릅니다. 이 자극에 대한 반응은 기본 '스파이크스'탭과 'Spk Wfms'탭을 시각하고 데이터 파일에서 분석할 수 있습니다.
- 실시간으로, 버스트는 여러 전극에 걸쳐 0.5V의 1 헤르츠 자극하는 시간 고정 방식으로 시각하실 수 있습니다. 그림 2는 이후의 자극 응답의 래스터 음모를 보여줍니다. 이전 관측 자극 - evoked 활동의 두 가지 유형이있다는 것을 증명하고있다 :. evoked 직접 행동 잠재력 (dAPs)와 synaptically evoked 행동 잠재력이 (얼간이) 20
- 문화의 뉴런이 활동의 자발적인 파열 수 있습니다. 실험 내용은 파열이 유형의 네트워크 역학을 제어하는 시도를 방해할 수 있습니다. 흥미롭게도, 전극마다 1-2 Hz에서에서 자극을 배포하는 것은 MEA에의 연결을 네트워크에서 활동을 파열 억제 시작할 수 있습니다. 21
MEAs에서 G. 문제 해결 기록
- 아무 작업 잠재력이나 소프트웨어가 켜져있는 MEA의 파열 현재 :
- 문화는 충분히 나이가? 액션 잠재력은 체외의 첫 번째 주말 방향으로 표시해야합니다. 터져나는 체외에서 2-3주 주위 발생합니다.
- 하드웨어가 전원을받을 수 있습니까? NeuroRighter 시스템은 전원 하드웨어를 두 6V 납산 배터리를 사용합니다. 전원 스위치가 ON 위치와 청구 배터리에 있어야합니다.
- 문화가 살아 있나요? 때때로 이것은 특히 때문에 glial 세포 전면에 자라난의 밀도 이상의 문화에 확인하기 위해 도전하실 수 있습니다. 그러나, 하나는 건강한 나타나는 뉴런 (위상 콘트라스트 현미경 아래에서 반짝, 타원형 모양의 세포 기관) 및 손상 (조각되지 않음) 셀 프로세스를 찾을 수 있습니다. 눈에 띄는 오염이나 급속하게 저하 미디어 (매체 변화 사이의 유일한 1~2일 후 산성되는)에 대한 증거가있다면 또한 문화에 문제가있을 수 있습니다.
- 전극 임피던스는 무엇입니까? 여러 사용하는 동안, 마이크로 전극 또는 MEA의 절연이 저하될 수 있습니다. NeuroRighter는 전극 임피던스를 평가하는 기능이 있습니다. 1kHz 주변 15 일반 임피던스 수치가 10,000 100,000 Ohms 사이의 범위해야합니다. 높은 임피던스 미만 10,000 Ohms가 새는 절연 제를 제안 깨진 리드 또는 전극과 판독을 제안한다.
- 하드웨어 보드에 연결된 preamplifier는 무엇입니까? preamplifier는 하드웨어 보드에 연결 출력 케이블이 있어야합니다. preamplifier는 또한 주요 하드웨어 보드에 연결하고 오직 자극에 대한 중요한 네 작은 자극기 보드가 있습니다.
- NeuroRighter 소프트웨어 설정이 변경 적이 있습니까? 소프트웨어에서 하드웨어 구성 설정 작업 기록에 대한 정확한해야합니다. 업데이트된 버전과 여러 사용자가 변경 설정을 설치하면이 발생할 수 있습니다.
- MEA는 35-37 ° C에서인가? 냉각기 온도는 대뇌 피질의 네트워크에서 자발적인 활동의 감소로 이어질 수 있습니다. MEA가 몇 초 이상 밖으로 보육의되어 있으면 녹음 기후 제어 인큐베이터 내에서 발생 이후 이것은 보통 문제가되지 않습니다, 그러나 하나는 온도 평형에 대한 허용해야합니다.
- 지난 몇 시간에 매체에 변경되었습니다? 우리는 문화가 자주 수유 후 몇 시간 동안 소성 중단 관찰했습니다. 따라서, 그것은 먹이를하기 전에 실험을 실시하는 것이 좋습니다.
- 과도한 배경 잡음 포화 녹음 창에 전극 :
- MEA 충분한에서 전극로 preamplifier 핀 연락처입니까? 이 문제는 preamplifier 덮개, 쓰레기의 작은 조각, 중간의 드롭, 저하된 전극 표면 또는 뚜껑에서 중복 맑은 막에 고르지 핀에 의해 발생할 수 있습니다. 이러한 문제에 대한 연락처를 점검하는 것이 첫번째 단계입니다. 거리 청소 필요한 매체의 한 방울이있다 특히 70 % 에탄올에 배어 면봉으로 핀 조정하는 것은 때로는 접촉을 향상시킬 수 있습니다. 신호가 에탄올 증발까지 악화가 나타날 수 있습니다. </ 리>
- 전극이 손상을 표시됩니까? 가벼운 현미경으로 시각화는 때로는 해킹이나 유물이 유형에 선도적인 전극 절연 제를 pitted 공개 수 있습니다.
- 착용하거나 긁힌 연락처 패드 무엇입니까? 때때로 최적화하기가 어렵습니다 MEA 여러 전극 접촉이있을 수 있습니다. 이것은 여러 MEA의 사용 및 platings 후 더 일반적입니다. 골드 와이어 임신 고무 스페이서는 0.5mm 두께의 방향에서만 실시하고 MEA와 preamplifier 핀 접촉을 향상시킬 수 있습니다. 이 자료는 Fujipoly에서 제공되고 MEA와 뚜껑에 맞게 귀여운 수 있습니다.
- 전체 MEA 과도한 배경 잡음을 보여줍니다 :
- MEA에 접지 전극은 preamplifier의 접지 핀에게 문의할 수 있도록만큼 올바른 방향의 MEA가? MEA가 올바른 방향에있다면 다음에는 접선 문제 (2 AC 이상) 없습니다 확보하면 고려하는 것이 중요합니다. 채널 CR15은 preamp 섀시에 짧은 철사로 접지가? 내부 30 kOhm 저항을 통해 그것을 바닥에 점퍼를 사용하면 초과하는 소음이 발생할 수 있습니다.
- 주변 조명, 전원 또는 장비의 다른 조각의 간섭이 있나요? 간섭의 가장 일반적인 형태 중 하나는 조명 장비에서 60 Hz에서입니다. 녹음 시스템은 적절하게 접지해야합니다. 차폐 케이블은 노출도 배경 간섭을 감소에서 도움이 될 수 있습니다.
대표 결과
그림 1. 이것은의 연결을 네트워크에서 자발적인 활동 2 분 래스터 플롯이다. 각 검은 점이 실천 가능성을 나타냅니다. 활동의 두 파열은 파란 화살표로 표시됩니다. 여러 개의 전극을 통해 응답은 네트워크 연결의 기능입니다.
그림 2. 여기 자극 - evoked 활동 16 초 래스터 플롯이다. 레드 스타가 자극을 나타냅니다. 빨간색 화살표가 성공적으로 여러 전극에 걸쳐 시냅스 활동의 파열을 유도 오 자극을 보여줍니다. 때때로 자극은 파란색 화살표 여기 버스트를 얻을하지 않습니다.
Discussion
이 프로토콜은 방법을 문화에 대한 지침을 보여 주며의 연결을 미세 전극 배열에 네트워크뿐만 아니라에서 녹화 및 네트워크의 연결을 자극에 대한 소개를 유지합니다. MEAs에서 녹화 더 일반적인 문제 중 일부는 또한 MEA 문제 해결 섹션에서 논의되었습니다. 전반에 걸쳐 논의하고 자주 이러한 변화는 특정 실험 설계에서 요구하는 특정 조건을 최적화하기 위해 활용하는 범위 내에서 프로토콜 가끔 차이가 있습니다.
여기에 제시된 기록하고 자극 시스템 MCS의 preamp와 NeuroRighter 15 설계된 우리의 사용자 정의 구성이지만,의 연결 네트워크 인터페이스를 제공할 수있는 여러 다른 시스템이있다. 특정 설정을 선택하면 특정 실험 요구 사항에 따라 달라집니다.
간단한 녹음 및 자극의 예제 MEAs에 그러나 이러한 문화는 시냅스의 연결 활동과 네트워크 연결에 관한 복잡한 질문에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수있는이 프로토콜에서 제공되었습니다. 위에서 언급한 바와 같이 지속적인 작업이 세포 소성과 같은 프로세스를 연구하기 위해이 기술을 활용이며, 개발, excitotoxicity 및 neurodegeneration. 6-10 예를 들어, 우리의 실험실에서 최근 간행물 재현성 목표가 실시간 폐루프 자극과 함께 체외로 배우는 감독했다 현재의 연결을 네트워크 활동 3 응답.
MEA의 문화가 자주 몹시 신경을 쓰는하고 섬세한 있지만, 그들의 단순 성과 접근성 (그대로 동물에 비해) 덕분에, 그들은 네트워크 수준의 연결 활동을 공부위한 강력한 모델을 제공합니다.
Disclosures
CMH는 공개 아무것도 없습니다.
Acknowledgments
우리는 프로토콜에 대한 귀중한 의견을 제공 포터 그룹의 구성원을 감사드립니다. ;이 작품은 신경과 재단의 미국 아카데미에서 CMH하는 임상 연구 교육 교제, 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIGMS의 친교에 의해 투자되었다 http://www.nigms.nih.gov/ JDR하기 (GM08169) ), NIH 국립 신경 장애 연구소에서 부여 뇌졸중 (NS054809) JDR에 루스 L. Kirschstein 내셔널 리서치 서비스 수상 (NS060392), NSF EFRI 부여 (0836017), 쿨터 재단 Translational 연구 상,와 JDR에 translational 연구 활동 (NS007480).
Materials
Supplies
Equipment:
Solutions and Reagents: BSA solution: Cell Medium: Dissection solution for preparing papain solution:23
This solution can be prepared ahead of time and stored at 4°C for several months. DNAse I: Hank’s balanced salt solution: Hibernate solution: Laminin solution: Papain solution:23 Polyethyleneimine (PEI) solution:13 Sterile de-ionized water: Trypsin (0.25% with EDTA, Gibco 25200): |
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References
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