Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Summary

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Abstract

Die Bemühungen durch eine Reihe von Influenza Forschergruppen haben maßgeblich an der Entwicklung und Verbesserung von Influenza A-Virus durch reverse Genetik. Ursprünglich im Jahr 1999 gegründet

Protocol

1. Influenza-Virus zu retten Transfektion

Influenza A-Virus gehört zur Familie der Orthomyxoviridae negativen RNA-umhüllte Viren. Das Influenza-A-Virus-Genom besteht aus acht verschiedenen RNA-Gene von negativer Polarität, dass codieren mindestens ⁴ 11 virale Proteine ​​(Abbildung 1). Wir konzentrieren wird, in diesem Bericht über die Rettung eines der am häufigsten Laborstamm, Influenza A/PR/8/34, ⁵ mit AmbiSense Plasmide (PDZ) mit der 8 Influenza A/PR/8/34 viralen Segmente ( Abbildung 2).

Für die Rettung von rekombinanten Influenza-Viren von Plasmid-DNA, empfehlen wir 3 unabhängige Transfektionen pro rekombinanten Virus. Wenn mehr als ein rekombinantes Virus zu retten versucht wird, Skala die folgenden Schritte accordantly, um die Anzahl von Viren, gerettet zu werden. Die nach der Transfektion und Infektion Protokoll ist für 6-well-Platten hergestellt. Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 3 dargestellt.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) Mischung: Prepare 250 ul OptiMEM Medien und 6-8 pl LPF2000 pro Transfektion. Inkubieren für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Unterdessen bereiten sich die Plasmid-Transfektion Mischung.
2. Plasmid-Transfektion Mischung: Bereiten Sie die Plasmid-Transfektion Cocktail in 50 ul OptiMEM Medien. Wir verwenden normalerweise 1 pg jedes Influenza-DNA-Plasmid pro retten. Add 1 ul der PDZ-Plasmiden (bei 1 ug / ul) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M und NS in ein Röhrchen mit 50 ul OptiMEM Medien.
3. OptiMEM-LPF2000-DNA-Plasmid-Gemisch: In 250 ul aus Schritt 1.1 in die Influenza-DNA-Plasmid-Transfektion Mischung (Schritt 1,2). Inkubieren Sie diese Mischung für 20-30 Minuten bei RT. In der Zwischenzeit bereiten Suspensionen von 293T und MDCK-Zellen für die Transfektion.
4. Vorbereitung der 293T/MDCK Co-Kultur: Bevor Sie beginnen, bringen die PBS 1X, DMEM 10% FBS 1% PS Medien und EDTA-Trypsin-Gemisch auf 37 ° C. Die Dichte der Zellen sollte bei 80-90% Konfluenz Tag der Transfektion werden. Normalerweise kann man konfluenten 100 mm Schale von 293T und einem konfluenten 100 mm Schale von MDCK-Zellen für 10-12 verwendet werden rettet. Wir werden 250 ul Zellen pro Vertiefung verwendet werden. Beide Zelllinien werden in insgesamt 3 ml DMEM 10% FBS 1% PS resuspendiert werden.
   • Vorsichtig resuspendieren jeder Zelllinie in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Sie haben eine Röhre für 293T-Zellen und eine Tube für MDCK-Zellen.
   • Resuspendieren 293T-Zellen in 3 ml DMEM 10% FBS 1% PS und wenn resuspendiert, liefern die 3 ml der MDCK-Zellen, diese Zellen zu resuspendieren. Dadurch erhalten Sie die Mischung aus 293T und MDCK-Zellen für Ihre Co-Kultur verwendet werden.
   • Add 250 ul der 293T/MDCK Zellen pro Well (10-12 6-well Brunnen).
5. Nach 20-30 Minuten RT Inkubation (Schritt 1,3), 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS auf die OptiMEM-LPF2000-Influenza-DNA-Plasmid-Gemisch.
6. Fügen Sie die 1,3 ml (Schritt 1,5) in die Vertiefungen mit dem 250 ul 293T/MDCK Zellen (Schritt 1,4).
7. Schütteln Sie die 6-well-Platte und lassen Sie die Transfektion inkubiert über Nacht (ON) in den Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO _2.
8. Am nächsten Tag, ca. 16-24 Stunden nach der Transfektion, ändern Sie die Transfektion Medien und inkubieren Sie die transfizierten Zellen in DMEM 0,3% BA 1% PS mit 1 pg / ml TPCK-Trypsin für 48 Stunden.
9. Nach 48 Stunden der Veränderung der Medien, den Überstand der transfizierten Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
10. Centrifuge das Gewebe Kulturüberstand in einer Mikrozentrifuge für 1-2 Minuten, 13.000 Umdrehungen pro Minute.
11. Infect frischen MDCK-Zellen in 6-well-Platten (vernickelt am Vortag) oder 10-Tage alten Hähnchen embryonierten Eier mit 200 ul zentrifugiert Gewebe Kulturüberständen von Schritt 1,10. Inkubieren Sie die Zellen und / oder Eier bei 37 ° C für 2-3 Tage.
    1. Die Infektion von 10-Tage alten Hähnchen embryonierten Eiern: Alle Verfahren, die Hühner embryonierten Eier infizieren werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
       1. Candle die 10-Tage alte Eier mit einem Licht-Durchleuchten Feld, um die Schnittstelle zwischen den Luftsack und die Allantoishöhle sehen. Machen Sie einen Bleistift an der Schnittstelle Grenze.
       2. Mit einer 5 ml Spritze Nadel ein Loch in die Eierschale.
       3. Mit einer 1 ml Spritze zu infizieren jedes Ei mit 200 ul des Gewebes Kulturüberständen von Schritt 1,10.
       4. Decken Sie das Loch in der Eierschale mit geschmolzenem Wachs mit einem Wattestäbchen.
       5. Inkubieren Sie die infizierten Eiern 37οC für 2-3 Tage.
    2. Die Infektion von frischen MDCK-Zellen: Der Tag vor dem Durchgang der Gewebekultur Überstand aus der 293T/MDCK Co-Kulturen, vorpare 6-Well-Platte Gerichte mit MDCK-Zellen zu erreichen 80-90% Konfluenz am nächsten Tag. Normalerweise kann eine konfluente 100 mm Gewebekulturplatte in 6-8 Bohrungen aufgeteilt werden. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS 1X, trypsinize und bereiten die 6-well Platten. Vorsichtig von Hand schütteln die Platten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen haben. Kultur der Zellen, ON, in der 37 ° C Inkubator, 5% CO _2. Vor der Infektion, überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um eine Monoschicht bestätigen, dann, mit der Infektion vor:
       • Wash-Zellen, zweimal mit 1 ml PBS 1X.
       • Infect mit 200 ul zentrifugiert Gewebe Kulturüberständen für 1 Stunde bei RT. Lassen Sie sich nicht die Zellen trocknen. Rock the 6-well-Platte alle 10 Minuten.
       • Nach 1 Stunde virale Absorption, entfernen Sie die Infektion Medien aus dem MDCK-Zellen und 2 ml DMEM 0,3% BA 1% PS mit 1 pg / ml TPCK-Trypsin.
       • Bei 48-72 Stunden nach der Passage, in Abhängigkeit von der Transfektionseffizienz und der Viruslast, wird ein zytopathischen Effekts (CPE) in den MDCK infizierten Zellen beobachtet werden. CPE deutet auf eine erfolgreiche Rettung. Sollte jedoch ein HA-Test (Abschnitt 2) noch durchgeführt, um die Präsenz des Virus im Gewebe Kulturüberständen zu bestätigen.
12. Ernte Allantoisflüssigkeit von infizierten Hühnern embryonierten Eiern: Alle Verfahren, die Allantoisflüssigkeit aus infizierten Eiern Ernte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Etwa 8-12 ml des Allantoisflüssigkeit kann von jedem 10-day-old-infizierte Eier geerntet werden. Vor der Ernte der Allantoisflüssigkeit, bebrüten die Hühnereier für 2 Stunden (oder ON) bei 4 ° C, um den Hühnerembryo töten und Koagulation des Blutes.
    • Waschen Sie die Eierschalen mit 70% Ethanol, um sterile Bedingungen zu schaffen.
    • Öffnen Sie das Ei vorsichtig über den Luftraum, indem Sie mit einem Löffel. Entfernen Sie die kaputte Eierschale mit Hilfe einer Pinzette.
    • Mit einer 1 ml Nadel, entfernen Sie die Allantois, ohne das Ei ist Eigelb.
    • Stabilisierung der Hühnerembryo mit einem Spatel, wie Sie einer 10 ml Pipette Führung in der Allantoisflüssigkeit. Sammeln Sie so viele Allantoisflüssigkeit wie möglich in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen auf Eis in einem Eiskübel, ohne zu brechen oder das Sammeln einer der Eizelle Dotter. Verwenden Sie ein 15 ml Zentrifugenröhrchen für jedes Ei.
    • Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 4 ° C und übertragen die Allantoisflüssigkeit (ohne Berücksichtigung pelletiert roten Blutkörperchen), um ein frisches 15 ml Zentrifugenröhrchen.
    • Bewahren Sie die Röhrchen mit dem zentrifugiert Allantoisflüssigkeit bei 4 ° C, bis sie auf das Vorhandensein von gerettet Virus mit einer Hämagglutination (HA)-Test überprüft.

2. HA-Test, um die Rettung von rekombinanten Influenzaviren bestätigen

Hämagglutinationstest (HA) wird routinemäßig verwendet werden, um die Anwesenheit der geretteten Virus in MDCK Zellkultur-Überstände und / oder der Allantoisflüssigkeit geerntet Eier zu erkennen. Alternativ können Immunfluoreszenz-Assays (IFA) auch durchgeführt werden. Sobald ein Test identifiziert die Anwesenheit von Viren befreit, sollte das Virus plaquegereinigt und die genetische Zusammensetzung des Virus wird durch RT-PCR und Sequenzierung bestätigt werden.

Die Anwesenheit des Virus in den MDCK Zellkultur-Überstände und / oder in der Allantoisflüssigkeit aus infizierten Eiern bestimmt makroskopisch mit HA vom Huhn (oder einer anderen Quelle) roten Blutkörperchen (RBC) werden. Das Vorhandensein von Viren induziert Hämagglutination von RBC, während das Fehlen des Virus ermöglicht die Bildung einer rot Pellet am Boden des Brunnens (Abbildung 4). Im Fall von Influenza-Virus, wird angenommen, dass etwa 10 ³ -10 ⁴ Plaque-bildenden Einheiten (PFU) erforderlich sind, um ein positives Signal in den HA-Test geben, weshalb eine IFA können parallel mit dem HA-Test durchgeführt werden, um zu bestätigen ein wahres negatives Ergebnis. IFA mit primären anti-Influenza-Antikörper ist empfindlicher als die HA-Test, weil weniger als 103-104 Viren mit dieser Technik nachgewiesen werden kann. Es ist möglich, als Überstände oder Allantois-Flüssigkeit, die HA-negativ sind positiv von der IFA. In diesem Fall sollte das Virus durch Passagieren verstärkt werden, wieder in MDCK-Zellen oder in Eiern. Allantoisflüssigkeit und / oder Gewebe Kulturüberständen aus dem zweiten Durchgang sollte nun deutlich positiv in den HA-Test.

HA-Assays sind in V-Boden 96-well-Platten durchgeführt. Negative (z. B. PBS 1X) und positive (tissue Kulturüberständen und / oder Allantoisflüssigkeit aus einer Influenzavirus-Infektion) Kontrollproben sollten immer in einer HA-Assay zu validieren einbezogen werden.

• Geben Sie 50 ul PBS 1X in jedes Well der V-Boden 96-Well-Platte.
• Add 50 uldie MDCK Zellkultur-Überstände und / oder Allantoisflüssigkeit aus den infizierten Eiern in die erste Vertiefung und machen 2-fach serielle Verdünnungen für die folgenden Vertiefungen. Entsorgen Sie die zusätzlichen 50 ul aus den letzten gut.
• Dann werden 50 ul von 0,5% -1,0% Huhn roten Blutkörperchen (hergestellt in PBS 1X) in jede Vertiefung.
• Inkubieren Sie die V-Boden 96-Well-Platte für 30-45 Minuten (bis zu einem red dot ist sichtbar in den Boden einer negativen Kontrolle PBS Probe) auf Eis. Lesen und interpretieren die Ergebnisse wie in Abbildung 4 dargestellt.

3. Passage der Zellkultur-Überstände

Ein negatives Ergebnis in der HA-Test kann eine Folge der niedrigen Transfektionseffizienz mit niedrigen Virus im Gewebe Kulturüberständen und / oder Allantoisflüssigkeit werden. Passage dieser Proben in frischem MDCK und / oder Bruteiern ermöglicht Verstärkung des Virus (wie in Abbildung 3 dargestellt) Infektionen sind wie zuvor in Abschnitt 1.11.2 beschrieben, durchgeführt.

4. Repräsentative Ergebnisse

Erfolgreiche Influenza-Virus zu retten wird durch das Vorhandensein einer positiven HA-Assay (Abbildung 4) bestätigt werden. Darüber hinaus wird die Existenz von CPE in Zellen mit dem Gewebe Kulturüberständen oder mit dem Allantoisflüssigkeit aus Eiern infiziert deuten auf eine positive viral zu retten.

Abbildung 1. Influenza Virus-Struktur: Influenza-Virus wird durch eine Lipid-Doppelschicht, die beiden viralen Glykoproteine ​​(HA, NA) und, umgeben auch die Ionenkanal-Protein, M2. HA ist die virale Attachment-Protein, verantwortlich für die Bindung an Sialinsäure-haltige Rezeptoren. NA ist verantwortlich für virale Freisetzung von Wirtszellen. Unter der Lipid-Doppelschicht, ist ein Protein Schicht der inneren Oberfläche Umschlag Matrix Protein 1, M1, die eine Rolle spielt in Virionen und Knospen und die nukleare Export-Protein (NEP), für die nukleare Export viraler ribonucleocapsids erforderlich zusammen. Der Kern des Virus besteht aus einem ribonucleoprotein (RNP)-Komplex hergestellt, bestehend aus 8 einsträngige RNA negativ viralen Gene durch die virale Nukleoprotein, NP eingekapselt. Im Zusammenhang mit dem RNP-Komplex der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Untereinheiten PA, PB1, PB2 und. Die Nicht-Strukturproteine ​​NS1 und PB1-F2, durch die RNA-Segmente NS und PB1 bzw. kodiert, sind nicht Bestandteil des Virion-Struktur.

Abbildung 2. Influenza-Virus zu retten Plasmide: Die acht Influenza-Virus Gene in die AmbiSense Plasmid PDZ geklont werden angezeigt. PDZ Plasmid ^6, aus dem Protein Expressionsplasmid pCAGGs ⁷ abgeleitet, ist eine bidirektionale Plasmidvektor mit einem menschlichen RNA-Polymerase I-Promotor und eine Maus Terminator-Sequenz, dass die negativen Sinne genomische RNA kodiert; in entgegengesetzter Orientierung auf der Polymerase I zu vereinen, eine Polymerase II Transkription Kassette (chicken β-Aktin-Promotor und polyA) kodiert für die viralen Proteine ​​aus der gleichen Virus-Gen. cDNAs aus jeder viralen Segment werden durch RT-PCR mit Vorwärts-und Rückwärts-Primer enthält die SAPI Restriktionsendonukleasestelle und die nicht-kodierenden Regionen der einzelnen Segmente (black boxes am Ende der viralen Gene) generiert. Das PCR-Produkt wird in den PDZ mit Sap-I verdaut geklont.

Abbildung 3. Acht-Plasmid-basierte Influenza-Rescue-System: PDZ Plasmide, welche der 8 Influenza Virus-Gene sind co-transfiziert, in Suspension, in 293T-MDCK-Zellen Co-Kulturen (Tag 1). Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion, Medien, ohne FBS aber mit TPCK / Trypsin ersetzt wird (Tag 2). Achtundvierzig Stunden nach dem Wechsel Medien, wird das Gewebe Kulturüberstand geerntet und verwendet werden, um MDCK oder 10-Tage alten bebrüteten Hühnereiern (Tag 4) zu infizieren. 48-72 Stunden nach der Amplifikation, Gewebe Kulturüberständen von MDCK infizierten Zellen oder Allantoisflüssigkeit aus Eiern werden geerntet und auf Vorhandensein von Viren durch HA (Tag 6). Wenn kein Virus entdeckt wird, kann die gleiche Überstände und / oder Allantois-Flüssigkeit in frisch MDCK Zellen und / oder Bruteiern wieder passagiert werden.

Abbildung 4. Hämagglutinin-Assay (HA): Hemagglutination von RBC durch Virus-Partikel ist makroskopisch sichtbar und ist die Basis für virale Partikel im Gewebe Kulturüberständen und / oder Allantois-Flüssigkeit zu erkennen. Obwohl die HA-Test unterscheidet nicht zwischen viralen Partikel, die infektiös sind und Partikel, die abgebaut werden und nicht mehr in der Lage, Zellen zu infizieren sind, diskriminieren, ist der Test ein guter Indikator für Vorhandensein von Viren in Proben. A) die Abwesenheit (oben) von Präsenz (unten) des Virus in den biologischen Proben wird durch die Anwesenheit von RBC in der Unterseite der Platte oder ihre Abwesenheit, bzw. ermitteltectively. B) Ein repräsentatives Ergebnis aus einer HA-Test ohne nachweisbare Mengen des Virus (oben) oder Anwesenheit (unten) des Virus gezeigt.

Discussion

Rettung von rekombinanten Influenza-Viren von Plasmid-DNA ist ein einfacher und unkomplizierter Vorgang, sobald das Protokoll routinemäßig im Labor durchgeführt, aber am Anfang, mehrere Dinge schief gehen kann. Es ist zwingend notwendig, um gute Plasmidpräparation haben, um das Virus zu erzeugen. Die richtige Wartung der Zelllinien (293T und MDCK) ist entscheidend für eine erfolgreiche virale retten. Traditionell ist eine genetische Tag in einer Influenza-Gen-kodierenden Plasmid eingefügt, durch stille Mutagenese. Die Einführung dieser stille Mutation (en) und die Schaffung von, zum Beispiel, ist ein neuartiges Restriktionsenzymstelle verwendet, um zwischen Wildtyp und rekombinanten Influenza-Virus durch das Enzym die Verdauung zu unterscheiden. Deshalb wird nach Verstärkung des Plaque-gereinigt rekombinanten Virus, sollte RT-PCR und Sequenzierung Ansätze durchgeführt, um die Natur der geretteten Virus zu überprüfen. Die Entwicklung dieser reversen Genetik Techniken und erfolgreiche Rettung von rekombinanten Influenza-Viren aus Plasmiden können Sie spezifische Fragen über die Biologie des Virus zu beantworten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.