Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Summary

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Abstract

Esforços por um número de grupos de pesquisa da gripe têm sido fundamental no desenvolvimento e melhoria da influenza A genética reversa do vírus. Originalmente estabelecida em 1999

Protocol

1. Influenza transfecção de resgate de vírus

Vírus influenza A pertence à família Orthomyxoviridae de vírus de RNA de fita negativa envolvido. A influenza A genoma do vírus é composto por oito genes diferentes de RNA de polaridade negativa que codificam, pelo menos, 11 proteínas virais (Figura 1) ^4. Vamos nos concentrar, neste relatório, sobre o resgate de um dos cepa de laboratório mais comum, a influenza A/PR/8/34, ⁵ usando plasmídeos ambisense (PDZ), contendo os 8 influenza A/PR/8/34 segmentos viral ( Figura 2).

Para o resgate de vírus de influenza recombinante de DNA plasmídeo, recomendamos 3 transfections independentes por cada vírus recombinante. Se mais de um resgate vírus recombinante é tentada, escala os seguintes passos accordantly ao número de vírus para ser resgatado. A transfecção seguinte e protocolo de infecção é estabelecida para 6-bem-pratos. Uma representação esquemática do protocolo é ilustrada na Figura 3.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mistura: Prepare 250 L de mídia OptiMEM e 6-8 mL de LPF2000 por transfecção. Incubar por 5-10 minutos em temperatura ambiente (RT). Enquanto isso, prepare a mistura de transfecção do plasmídeo.
2. Mistura de transfecção do plasmídeo: Prepare o coquetel de transfecção do plasmídeo em 50 ul de mídia OptiMEM. Nós usamos geralmente 1 mg de cada DNA influenza plasmídeo por socorro. Adicionar 1 ml de os plasmídeos PDZ (a 1 mg / mL) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M e NS para um tubo contendo 50 mL dos meios de comunicação OptiMEM.
3. OptiMEM-LPF2000-DNA plasmídeo mistura: Adicionar 250 L a partir do passo 1,1 na mistura de transfecção influenza DNA plasmídeo (passo 1.2). Incubar a mistura por 20-30 minutos em temperatura ambiente. Enquanto isso, preparar suspensões de células MDCK 293T e de transfecção.
4. Preparação de 293T/MDCK co-cultura: Antes de começar, trazer a 1X PBS, DMEM 10% FBS 1% PS mídia e EDTA-tripsina mistura a 37 ° C. A densidade das células deve ser a confluência de 80-90% no dia da transfecção. Geralmente, um prato milímetros confluentes 100 de 293T e um prato milímetros confluentes 100 de células MDCK pode ser usado por 10-12 resgates. Nós vamos usar 250 L de células por poço. Ambas as linhas de células será ressuspenso em um total de 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1%.
   • Ressuspender cuidadosamente cada linha de células em 10 ml de DMEM 10% FBS PS 1% em um tubo de centrifugação de 15 ml. Você terá um tubo de células 293T e um tubo de células MDCK.
   • Ressuspender as células 293T em 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1% e quando ressuspenso, entregar a 3 ml para as células MDCK para ressuspender as células. Isto lhe dará a mistura de células MDCK 293T e para ser usado para o seu co-cultura.
   • Adicionar 250 mL das células 293T/MDCK por poço (10-12 junho bem-poços).
5. Após 20-30 minutos de incubação RT (passo 1.3), adicionar 1 ml de DMEM 10% FBS PS 1% para a mistura de DNA OptiMEM-LPF2000-influenza plasmídeo.
6. Adicione o ml 1.3 (passo 1.5) para os poços com a 250 mL de células 293T/MDCK (passo 1.4).
7. Agite suavemente o 6-bem-placa e deixar a incubar transfecção overnight (ON) na incubadora a 37 ° CO C e 5% _2.
8. No dia seguinte, cerca de 16-24 horas após a transfecção, alterar a mídia de transfecção e incubar as células transfectadas em DMEM BA 0,3% a 1% PS contendo 1 mg / ml de TPCK-tripsina por 48 horas.
9. Após 48 horas de mudar a mídia, transferir o sobrenadante das células transfectadas em um tubo de microcentrífuga.
10. Centrifugar o sobrenadante de cultura de tecidos em microcentrífuga por 1-2 minutos, 13.000 rpm.
11. Infectar novas células MDCK em 6 bem-placas (banhado no dia anterior) ou ovos de 10 dias de idade embrionados de galinha com 200 mL do sobrenadante centrifugado cultura de tecidos a partir do passo 1.10. Incubar as células e / ou ovos a 37 ° C por 2-3 dias.
    1. Infecção de ovos de 10 dias de idade embrionados de galinha: Todos os procedimentos para infectar os ovos de galinha embrionados são realizados em condições estéreis.
       1. Vela os ovos de 10 dias de idade, usando uma caixa de luz candling para ver a interface entre o saco de ar e na cavidade alantóide. Faça uma marca de lápis na fronteira interface.
       2. Com uma agulha de seringa de 5 ml fazer um buraco na casca de ovo.
       3. Com uma seringa de 1 ml, infectar cada ovo com 200 mL do sobrenadante de cultura de tecidos a partir do passo 1.10.
       4. Cobrir o buraco na casca de ovo com cera derretida usando um cotonete.
       5. Incubar os ovos infectados em 37οC por 2-3 dias.
    2. Infecção de novas células MDCK: O dia antes da passagem do sobrenadante de cultura de tecidos a partir da 293T/MDCK co-culturas, prépare de 6 pratos bem placa com células MDCK para alcançar confluência de 80-90% no dia seguinte. Geralmente, um confluentes 100 milímetros placa de cultura de tecidos pode ser dividida em 6-8 poços. Lavar as células, duas vezes, com PBS 1X, trypsinize e preparar as placas de 6 poços. Agite suavemente com a mão as placas, a fim de ter uma distribuição uniforme das células. Cultura das células, ON, na 37 ° C incubadora, 5% CO _2. Antes da infecção, verifique as células ao microscópio para confirmar uma monocamada, então, prosseguir com a infecção:
       • Lave as células, duas vezes, com 1 ml de PBS 1X.
       • Infectar com o 200 mL do sobrenadante da cultura de tecidos centrifugada por 1 hora em temperatura ambiente. Não deixe que as células secas. Rock the 6-bem-placa a cada 10 minutos.
       • Após uma hora de absorção viral, remova a mídia infecção das células MDCK e adicionar 2 ml de DMEM BA 0,3% a 1% PS contendo 1 mg / ml de TPCK-tripsina.
       • Em 48-72 horas após a passagem, dependendo da eficiência de transfecção e da carga de vírus, um efeito citopático (CPE) será observado nas células MDCK infectados. CPE sugere um resgate bem sucedido. No entanto, um ensaio HA (seção 2) deve ainda ser realizados para confirmar a presença do vírus no sobrenadante de cultura de tecidos.
12. Colheita de fluido alantóide de ovos embrionados de galinha infectados: Todos os procedimentos para colher o fluido alantóide de ovos infectados são realizados em condições estéreis. Cerca de 8-12 ml de líquido alantóico podem ser colhidos de cada ovo de 10 dias de idade infectadas. Antes da colheita do líquido alantóico, incubar os ovos de galinha para 2 horas (ou ON) a 4 ° C para matar o embrião de galinha e coagular o sangue.
    • Lavar os ovos com etanol 70% para estabelecer condições estéreis.
    • Abra o ovo, com cuidado, sobre a cavidade do ar batendo com uma colher. Remova a casca quebrada com a ajuda de fórceps.
    • Com uma agulha de 1 ml, retire a membrana alantóide, sem quebrar a gema do ovo.
    • Estabilizar o embrião de galinha com uma espátula como você guia uma pipeta de 10 ml para o líquido alantóide. Recolher o líquido alantóico tanto quanto possível, em um tubo de centrífuga de 15 ml de gelo em um balde de gelo sem quebrar ou recolher qualquer gema do ovo. Use um tubo de centrifugação de 15 ml para cada ovo.
    • Centrifugar durante 5 minutos a 4 ° C e transferir o líquido alantóico (sem ter peletizada células vermelhas do sangue) para um novo 15 tubos de centrífuga ml.
    • Armazenar os tubos contendo o líquido alantóide centrifugadas a 4 ° C até que eles são verificados para a presença do vírus resgatado com um ensaio de hemaglutinação (HA).

2. HA ensaio para confirmar o resgate de vírus influenza recombinantes

Ensaio de hemaglutinação (HA) é rotineiramente usado para detectar a presença do vírus resgatados em sobrenadantes tecido MDCK cultura e / ou o fluido alantóide de ovos colhidos. Alternativamente, imunofluorescência (IFA) também pode ser realizada. Uma vez um ensaio identifica a presença do vírus resgatado, o vírus deve ser purificado e placa a composição genética do vírus será confirmada por RT-PCR e seqüenciamento.

A presença do vírus no tecido MDCK sobrenadantes de cultura e / ou no fluido alantóide de ovos infectados pode ser determinada macroscopicamente usando HA de frango (ou outra fonte) glóbulos vermelhos (RBC). A presença do vírus induz a hemaglutinação da RBC, enquanto a ausência de vírus permite a formação de uma pelota vermelha no fundo do poço (Figura 4). No caso do vírus da gripe, acredita-se que cerca de 10 ³ -10 ⁴ unidades formadoras de placa (UFP) são obrigados a dar um sinal positivo no teste de HA e, portanto, um IFA pode ser realizada em paralelo com o ensaio de HA para confirmar um resultado verdadeiro negativo. IFA com primário anti-influenza anticorpos é mais sensível que o ensaio HA porque menos de 103-104 vírus podem ser detectados com esta técnica. É possível que sobrenadantes ou líquidos alantóide que são HA-negativos são positivos pelo IFA. Neste caso, o vírus deve ser amplificada por passaging, novamente, em células MDCK ou em ovos. Líquido alantóico e / ou sobrenadantes de cultura de tecidos a partir da segunda passagem deve agora ser claramente positivo no ensaio HA.

HA ensaios são realizados em placas de 96 poços V-bottom. Negativo (por exemplo, PBS 1X) e positivo (sobrenadante de cultura de tecidos e / ou líquido alantóico de uma infecção pelo vírus influenza) amostras de controle deve sempre ser incluídos em qualquer ensaio de HA para validá-lo.

• Dispensar 50 ul de PBS 1X em cada poço da V bottom-96 poços da placa.
• Adicionar 50 ul deos sobrenadantes tecido MDCK cultura e / ou líquido alantóico dos ovos infectados para o primeiro poço e, fazer 2 diluições de série para os poços seguinte. Descartar a 50 mL extra do bem passado.
• Adicionar 50 ul de 0,5% -1,0% frango células vermelhas do sangue (preparado em PBS 1X) a cada poço.
• Incubar a V-bottom 96 poços da placa por 30-45 minutos (até um ponto vermelho é visível na parte inferior de uma amostra de controlo negativo PBS) no gelo. Ler e interpretar os resultados, conforme indicado na Figura 4.

3. Passagem de sobrenadantes de cultura de tecidos

Um resultado negativo no ensaio de HA pode ser um resultado da eficiência de transfecção baixa com baixos níveis de vírus presente estar no sobrenadantes de cultura de tecidos e / ou líquido alantóico. Passagem destas amostras em ovos frescos MDCK e / ou embrionados permitirá a amplificação do vírus (como indicado na Figura 3) As infecções são realizados conforme descrito anteriormente na seção 1.11.2.

4. Resultados representante

Resgate de vírus influenza sucesso será confirmada pela presença de um ensaio de HA positivo (Figura 4). Além disso, a existência de CPE em células infectadas com o sobrenadante de cultura de tecido ou com o fluido alantóide de ovos irá sugerir um resgate positivo viral.

Figura 1. Influenza estrutura Virus: vírus Influenza é cercada por uma bicamada lipídica que contém as duas glicoproteínas viral (HA, NA) e, também, a proteína canal iônico, M2. HA é a proteína viral anexo, responsável pela ligação com ácido siálico contendo receptores. NA é responsável pela libertação viral a partir de células hospedeiras. Debaixo da bicamada lipídica, é uma camada de proteína composta pelo interior de proteínas da matriz superfície do envelope 1, M1, que desempenha um papel no virion montagem e brotamento ea proteína nuclear de exportação (NEP), exigido para a exportação nuclear da ribonucleocapsids viral. O núcleo do vírus é feita de um complexo ribonucleoproteína (RNP), composto de 8 de single-stranded RNA viral negativa genes encapsidated pela nucleoproteína viral, NP. Associadas com o complexo RNP são as viral RNA polimerase dependente de RNA subunidades PA, PB1, PB2 e. As proteínas não estruturais NS1 e PB1-F2, codificada pelos segmentos de RNA NS e PB1, respectivamente, não são parte da estrutura do virion.

Figura 2. Plasmídeos de resgate de vírus influenza: A oito genes da influenza vírus clonados no PDZ ambisense plasmídeo são indicados. PDZ plasmídeo ^6, derivado da expressão da proteína plasmídeo pCAGGs ^7, é um vetor plasmídeo bidirecional com uma RNA polimerase humana Eu promotor e um rato uma sequência de terminador que codifica o RNA genômico sentido negativo, em orientação oposta à polimerase I unir, uma polimerase II cassete de transcrição (promotor de frango β-actina e poli) codifica as proteínas virais do mesmo gene viral. cDNAs de cada segmento viral são gerados por RT-PCR com primers frente e verso contendo o Sapi site de endonuclease de restrição e as regiões não-codificadoras de cada segmento (caixas-pretas no final dos genes virais). O produto da PCR é clonado no PDZ digerido com Sap-I.

Figura 3. Oito plasmídeo baseado em sistema de resgate influenza: PDZ plasmídeos contendo os genes 8 influenza viral são co-transfectadas, em suspensão, em 293T-MDCK células co-culturas (dia 1). Vinte e quatro horas após a transfecção, mídia sem FBS, mas contendo TPCK / tripsina é substituído (dia 2). Quarenta e oito horas após mudar a mídia, o sobrenadante de cultura de tecidos é colhida e utilizada para infectar células MDCK ou 10 dias de idade, ovos de galinha embrionados (dia 4). 48-72 horas pós-amplificação, sobrenadantes de cultura de tecidos de células infectadas ou MDCK líquido alantóico de ovos são colhidas e analisadas para a presença do vírus por HA (dia 6). Se nenhum vírus é detectado, os sobrenadantes mesmo e / ou líquidos alantóico podem ser re-frescos várias passagens em células MDCK e / ou ovos embrionados.

Figura 4. Hemaglutinina ensaio (HA): Hemaglutinação da RBC por partícula do vírus é visível macroscopicamente e é a base para detectar partículas virais em sobrenadante de cultura de tecidos e / ou líquidos alantóide. Embora o ensaio de HA não discrimina entre as partículas virais que são infecciosas e partículas que estão degradadas e não é capaz de infectar as células, o ensaio é um bom indicador da presença de vírus em amostras. A) Ausência (parte superior) da presença (em baixo) do vírus nas amostras biológicas é determinado pela presença de glóbulos vermelhos no fundo do prato ou a sua ausência, respectively. B) Um resultado representante de um ensaio HA sem níveis detectáveis ​​de vírus (superior) ou presença (parte inferior) do vírus é mostrado.

Discussion

Resgate de vírus influenza recombinante de DNA plasmídeo é um processo simples e direta uma vez que o protocolo é realizada rotineiramente no laboratório, mas no início, várias coisas podem dar errado. É imperativo ter boa preparação plasmídeo para gerar o vírus. Manutenção adequada das linhas celulares (293T e MDCK) é crucial para um resgate bem sucedido viral. Tradicionalmente, uma marca genética é inserido em um gene que codifica a gripe-plasmídeo, por mutagênese em silêncio. Introdução desta mutação silenciosa (s) e criação de, por exemplo, um romance do site enzima de restrição é usada para distinguir entre o tipo selvagem e recombinante do vírus da gripe por digestão enzimática. Portanto, após a amplificação da placa purificada vírus recombinante, RT-PCR e seqüenciamento abordagens devem ser realizados para verificar a natureza do vírus resgatados. O desenvolvimento destas técnicas de genética inversa e salvamento bem sucedida de vírus influenza recombinantes de plasmídeos lhe permitirá responder a perguntas específicas sobre a biologia do vírus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.