Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Summary

Rescue av influensa A-virus från plasmid-DNA är en grundläggande och viktig experimentell teknik som gör att influensa forskare att generera rekombinant virus för att studera flera aspekter i biologi influensavirus, och användas som potentiella vektorer eller vacciner.

Abstract

Insatser från ett antal influensa forskargrupper har varit avgörande för utveckling och förbättring av influensa A-virus genetik bakåt. Ursprungligen bildades 1999

Protocol

1. Influensavirus rädda transfektion

Influensa A-virus tillhör Orthomyxoviridae familj negativa RNA höljeförsedda virus. Det influensa A-virus arvsmassa består av åtta olika RNA-gener av negativ polaritet som kodar åtminstone 11 virala proteiner (Figur 1) ^4. Vi kommer att fokusera, i denna rapport, om att rädda en av de vanligaste laboratoriet stam, A/PR/8/34 influensa, ⁵ med ambisense plasmider (PDZ) som innehåller 8 influensa A/PR/8/34 virus segment ( Figur 2).

För att rädda rekombinanta influensavirus från plasmid-DNA, rekommenderar vi 3 oberoende transfections för varje rekombinant virus. Om mer än ett rekombinant virus räddning är försök, skala följande steg accordantly till antalet virus att bli räddade. Följande transfektion och infektion protokoll är upprättat för 6-väl-plattor. En schematisk bild av det protokoll som illustreras i figur 3.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) blandning: Förbered 250 ìl OptiMEM media och 6-8 ìl LPF2000 per transfektion. Inkubera i 5-10 minuter i rumstemperatur (RT). Under tiden förbereder plasmiden transfektion blandningen.
2. Plasmid transfektion blandning: Förbered plasmiden transfektion cocktail i 50 ìl OptiMEM medier. Vi använder vanligtvis 1 mikrogram i varje influensa DNA plasmid per räddning. Tillsätt 1 l av PDZ plasmider (vid 1 mikrogram / l) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, och NS till ett rör som innehåller 50 ìl OptiMEM medier.
3. OptiMEM-LPF2000-DNA-plasmid blandning: Tillsätt 250 l från steg 1,1 i influensa DNA plasmid transfektion blandning (steg 1,2). Inkubera denna blandning i 20-30 minuter vid RT. Under tiden förbereder suspensioner av 293T och MDCK celler för transfektion.
4. Beredning av 293T/MDCK co-kultur! Innan du börjar föra PBS 1X, DMEM 10% FBS 1% PS media, och EDTA-trypsin blandningen till 37 ° C. Densiteten av cellerna bör vara 80-90% sammanflödet dagen för transfektion. Vanligtvis kan en konfluenta 100 mm fat 293T och en konfluenta 100 mm fat MDCK celler kan användas för 10-12 räddningar. Vi kommer att använda 250 l av celler per brunn. Båda cellinjer kommer att resuspenderas i totalt 3 ml DMEM 10% FBS 1% PS.
   • Noggrant resuspendera varje cellinje i 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS i ett 15 ml centrifugrör. Du kommer att ha ett rör för 293T celler och ett rör för MDCK celler.
   • Resuspendera 293T cellerna i 3 ml DMEM 10% FBS 1% PS och när återsuspenderade, leverera 3 ml till MDCK celler att resuspendera dessa celler. Detta ger dig en blandning av 293T och MDCK celler som skall användas för din medverkan kultur.
   • Tillsätt 250 ìl av 293T/MDCK celler per brunn (10-12 6-väl brunnar).
5. Efter 20-30 minuter RT inkubationen (steg 1,3), tillsätt 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS till OptiMEM-LPF2000-influensa DNA plasmid blandning.
6. Tillsätt 1,3 ml (steg 1,5) i brunnarna med 250 ìl 293T/MDCK celler (steg 1,4).
7. Skaka försiktigt 6-väl-plattan och låt transfektion inkubera över natten (ON) i inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO _2.
8. Nästa dag, ungefär 16-24 timmar efter transfektion, ändra transfektion media och inkubera transfekterade celler i DMEM 0,3% BA 1% PS innehåller 1 mikrogram / ml TPCK-trypsin i 48 timmar.
9. Efter 48 timmar av att ändra media, överför supernatanten från transfekterade celler i ett mikrocentrifugrör.
10. Centrifugera supernatanten vävnadsodling i mikrocentrifug i 1-2 minuter, 13.000 rpm.
11. Infektera färska MDCK celler i 6-brunnars plattor (klädd dagen innan) eller 10-dagsgamla kyckling embryonerade ägg med 200 l av centrifugerat supernatanter vävnadsodling från steg 1,10. Inkubera cellerna och / eller ägg vid 37 ° C i 2-3 dagar.
    1. Infektion av 10-dagsgamla kycklingar embryonerade ägg: Alla förfaranden för att infektera kyckling embryonerade ägg utförs under sterila förhållanden.
       1. Candle den 10-dagar gamla ägg med en ljus-genomlysning rutan för att se gränssnittet mellan Luftsäcken och allantoiskaviteten. Gör en penna märke på gränssnittet gränsen.
       2. Med en 5 ml spruta nål göra ett hål i äggskal.
       3. Med en 1 ml spruta, infekterar varje ägg med 200 ìl av supernatanterna vävnadsodling från steg 1,10.
       4. Täck hålet i äggskal med smält vax med hjälp av en bomullspinne.
       5. Inkubera de infekterade äggen på 37οC 2-3 dagar.
    2. Infektion av färska MDCK celler: Dagen före passagen av vävnadskultur supernatant från 293T/MDCK co-kulturer, prepare 6-brunnar rätter med MDCK celler för att nå 80-90% sammanflödet nästa dag. Vanligtvis kan en konfluenta 100 mm vävnadsodling plattan delas upp i 6-8 brunnar. Tvätta cellerna, två gånger med PBS 1X, trypsinize och förbereda 6-brunnars plattor. Skaka försiktigt för hand plattorna för att få en enhetlig fördelning av cellerna. Kultur cellerna, ON, i 37 ° C inkubator, 5% CO _2. Innan infektion, kontrollera cellerna under mikroskop för att bekräfta ett monolager, sedan fortsätter du med infektion:
       • Tvätta celler, två gånger med 1 ml PBS 1X.
       • Smitta med 200 l av centrifugerat supernatanter vävnadsodling i 1 timme vid RT. Låt inte cellerna torka. Rock den 6-väl-plattan var 10 minut.
       • Efter en timme av virus absorption, ta bort infektionen media från MDCK cellerna och tillsätt 2 ml av DMEM 0,3% BA 1% PS innehåller 1 mikrogram / ml TPCK-trypsin.
       • Vid 48-72 timmar efter passage, beroende på transfektion effektivitet och virusmängd, kommer en cytopatisk effekt (CPE) observeras i MDCK infekterade celler. CPE föreslår en lyckad räddning. Dock bör en HA-analys (avsnitt 2) ändå utföras för att bekräfta förekomsten av viruset i supernatanterna vävnadsodling.
12. Harvest allantoisvätska från infekterade kyckling embryonerade ägg: Alla förfaranden för att skörda allantoisvätska från infekterade ägg utförs under sterila förhållanden. Ungefär 8-12 ml allantoisvätska kan skördas från varje 10-dagars-old-infekterade ägg. Före skörd av allantoisvätska, inkubera kycklingen ägg för 2 timmar (eller ON) vid 4 ° C för att döda kycklingen embryot och koagulerar blodet.
    • Tvätta äggskalen med 70% etanol för att upprätta sterila förhållanden.
    • Öppna ägg, försiktigt, över luftspalten genom att knacka med en sked. Ta bort den trasiga äggskal med hjälp av pincett.
    • Med en 1 ml nål, avlägsna allantois membranet utan att bryta äggets äggula.
    • Stabilisera kycklingen embryo med en spatel när du vägleder en 10 ml pipett i allantoisvätska. Samla in så mycket allantoisvätska som möjligt i ett 15 ml centrifugrör på is i en ishink utan att bryta eller samla några av äggets äggula. Använd ett 15 ml centrifugrör för varje ägg.
    • Centrifugera i 5 minuter vid 4 ° C och överför allantoisvätska (utan hänsyn pelleterat röda blodkroppar) till ett nytt 15 tuber ml centrifugen.
    • Förvara rören innehåller centrifugeras allantoisvätska vid 4 ° C tills de kontrolleras för förekomst av räddade virus med en hemagglutination (HA)-analysen.

2. HA-analys för att bekräfta att rädda rekombinanta influensavirus

Hemagglutination analys (HA) är rutinmässigt används för att påvisa förekomsten av räddade virus i MDCK supernatanter vävnadsodling och / eller allantoisvätska skördade ägg. Alternativt kan immunofluorescens analyser (IFA) också utföras. När en analys identifierar närvaron av räddade virus bör viruset plack renas och den genetiska sammansättningen av viruset kommer att bekräftas genom RT-PCR och sekvensering.

Förekomsten av virus i MDCK supernatanterna vävnadsodling och / eller i allantoisvätska från smittade ägg kan bestämmas makroskopiskt med HA av kyckling (eller annan källa) röda blodkroppar (RBC). Förekomsten av virus inducerar hemagglutination av RBC, medan frånvaro av viruset gör det bildas en röd pellets i botten av brunnen (Figur 4). I fallet av influensa-virus, tror man att cirka 10 ³ -10 ⁴ plack bildas enheter (PFU) krävs för att ge en positiv signal i HA-bestämning, därför kan ett IFA utföras parallellt med HA-analysen för att bekräfta en sann negativt resultat. IFA med primär anti-influensa-antikroppar är känsligare än HA-analysen, eftersom mindre än 103-104 virus kan upptäckas med denna teknik. Det är möjligt än supernatanterna eller allantoisvätska som är HA-negativa är positiva av IFA. I detta fall bör viruset skulle förstärkas av passaging, igen, i MDCK celler eller i ägg. Allantoisvätska och / eller vävnad supernatanter kultur från andra passagen bör nu vara klart positiv i HA-analysen.

HA-analyser utförs i V-botten plattor med 96 brunnar. Negativ (t.ex. PBS 1X) och positiva (vävnadsodling supernatanterna och / eller allantoisvätska från en influensavirusinfektionen) bör kontrollprover alltid ingå i en HA-test för att bekräfta det.

• Dispensera 50 l PBS 1X i varje brunn i V-botten 96-brunnar.
• Tillsätt 50 ìlden MDCK vävnadsodling supernatanterna och / eller allantoisvätska från den smittade ägg till den första brunnen och gör 2-faldigt seriella spädningar för de följande brunnar. Kasta den extra 50 l från den senaste väl.
• Tillsätt 50 l på 0,5% -1,0% kyckling röda blodkroppar (upprättad i PBS 1X) till varje brunn.
• Inkubera V-botten 96-brunnar i 30-45 minuter (tills en röd prick syns i botten av en negativ kontroll PBS prov) på is. Läs och interpretate resultaten som visas i Figur 4.

3. Passage av supernatanterna vävnadsodling

Ett negativt resultat i HA-analysen kan vara en följd av låga transfektion effektivitet med låga nivåer av virus som finns i supernatanterna vävnadsodling och / eller allantoisvätska. Passage av dessa prover i färskt MDCK och / eller embryonerade ägg gör att förstärkningen av viruset (som visas i figur 3) Infektioner utförs som tidigare beskrivits i avsnitt 1.11.2.

4. Representativa resultat

Framgångsrika influensavirus rädda bekräftas av förekomsten av en positiv HA analys (Figur 4). Dessutom kommer förekomsten av CPE i celler infekterade med supernatanterna vävnadsodling eller med allantoisvätska från ägg tyder på en positiv viral räddning.

Figur 1. Influensavirus struktur: Influensavirus är omgiven av en membranet innehåller de två virala glykoproteiner (HA, NA) och också de jonkanaler protein, M2. HA är det virala bifogade protein, ansvarig för bindning till sialinsyra innehåller receptorer. NA är ansvarig för viral befrielse från värdceller. Under membranet, är ett protein lager som består av insidan kuvertet matrixprotein 1, M1, som spelar en roll i virionens montering och spirande och nukleära exportera protein (NEP), som krävs för kärnvapen export av viral ribonucleocapsids. Kärnan av viruset är gjord av en ribonucleoprotein (RNP) komplex, som består av 8 enkelsträngade negativa RNA virala gener encapsidated av virala nukleoprotein, NP. Associerade med RNP komplexet är den virala RNA-beroende RNA-polymeras subenheter PA, PB1 och PB2. Den icke-strukturella proteiner NS1 och PB1-F2, kodas av RNA segment NS och PB1, respektive inte ingår i virionens struktur.

Figur 2. Influensavirus rädda plasmider: De åtta influensavirus gener klonade in i ambisense plasmiden PDZ anges. PDZ plasmid ^6, härrör från proteinuttryck plasmiden pCAGGs ^7, är en dubbelriktad plasmidvektorn med ett mänskligt RNA-polymeras jag promotor och en mus terminator sekvens som kodar negativa RNA bemärkelse genetiska, i motsatt riktning till polymeras jag förena, ett polymeras II transkription kassett (kyckling β-aktin och promotorn Polya) kodar virala proteiner från samma gener. cDNAs från varje virus segment genereras av RT-PCR med framåt och bakåt grundfärger innehåller Sapi webbplatsen begränsningen endonuclease och regionerna icke-kodande i varje segment (svarta lådor i slutet av virusets gener). PCR-produkten är klonad i PDZ kokas med SAP-I.

Figur 3. Åtta-plasmid-baserad influensa räddningssystem: PDZ plasmider innehåller 8 influensa virala gener är co-transfekterade, i suspension, i 293T-MDCK celler co-kulturer (dag 1). Tjugofyra timmar efter transfektion, media utan FBS men innehållande TPCK / trypsin ersätts (dag 2). Fyrtioåtta timmar efter byte av media, är vävnadskultur supernatant skördas och användas för att infektera MDCK eller 10-dagar gamla embryonerade hönsägg (dag 4). 48-72 timmar efter förstärkning, vävnadskultur supernatanterna från MDCK infekterade celler eller allantoisvätska från ägg skördas och analyseras för förekomst av virus av HA (dag 6). Om inget virus upptäcks, kan samma supernatanterna och / eller allantoisvätska åter passerats i friska MDCK celler och / eller embryonerade ägg.

Figur 4. Hemagglutinin analys (HA): Hemoglobinprov av RBC av virus partikel är synlig makroskopiskt och är grunden för att upptäcka viruspartiklar i supernatanter vävnadsodling eller / och allantoisvätska. Även om HA-analysen inte diskriminerar mellan viruspartiklar som är smittsamma och partiklar som bryts ned och inte längre kan infektera celler, är analysen en bra indikator på förekomsten av virus i prover. A) frånvaro (överst) av närvaro (botten) av virus i biologiska prover bestäms av förekomsten av RBC i botten av tallriken eller deras frånvaro, respectively. B) en representant resultat från en HA-analys utan detekterbara halter av virus (överst) och närvaro (botten) av virus visas.

Discussion

Räddning av rekombinant influensavirus från plasmid-DNA är en enkel och okomplicerad process när protokollet rutinmässigt utförs i laboratoriet, men i början kan flera saker går fel. Det är viktigt att ha bra plasmid förberedelser för att skapa viruset. Korrekt underhåll av cellinjer (293T och MDCK) är avgörande för en framgångsrik viral räddning. Traditionellt är en genetisk tagg in i en influensa gen-kodning plasmid genom tysta mutagenes. Införandet av denna tysta mutation (er) och inrättandet av, till exempel, är en roman restriktionsenzymanalys webbplats används för att skilja mellan vild-typ och rekombinant influensavirus av enzym matsmältningen. Därför, efter amplifiering av plack renade rekombinanta virus bör RT-PCR och sekvensering metoder utföras för att kontrollera arten av de räddade viruset. Utvecklingen av dessa omvänd genetik tekniker och lyckad räddning av rekombinant influensavirus från plasmider gör att du kan svara på specifika frågor om biologi av viruset.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.