Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Summary

Sauvetage des virus grippaux A partir de l'ADN plasmidique est une technique de base et essentiels expérimentale qui permet aux chercheurs de la grippe pour générer des virus recombinants pour étudier les multiples aspects de la biologie du virus de la grippe, et pour être utilisés comme vecteurs potentiels ou de vaccins.

Abstract

Les efforts déployés par un certain nombre de groupes de recherche sur la grippe ont été crucial dans le développement et l'amélioration de la grippe A génétique inverse du virus. Initialement créé en 1999

Protocol

1. Transfection grippe du virus de secours

Virus Influenza A appartient à la famille des Orthomyxoviridae des virus à ARN négatif brin enveloppé. La grippe A génome du virus est constitué de huit gènes de l'ARN de polarité négative différents qui codent au moins 11 protéines virales (figure 1) ^4. Nous allons nous concentrer, dans ce rapport, sur le sauvetage de l'un de la souche de laboratoire la plus courante, la grippe A/PR/8/34, ⁵ l'aide de plasmides ambisens (PDZ) contenant les huit segments de la grippe A/PR/8/34 virale ( Figure 2).

Pour le sauvetage des virus grippaux recombinants à partir d'ADN plasmidique, nous recommandons trois transfections indépendantes pour chaque virus recombinant. Si plus d'un sauvetage virus recombinant est tenté, à l'échelle les étapes suivantes accordantly le nombre de virus pour être sauvés. La transfection suivants et le protocole de l'infection est établie pour 6-bien-assiettes. Une représentation schématique du protocole est illustré à la figure 3.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mélange: Préparer 250 pi de médias OptiMEM et 6-8 pl d'LPF2000 transfection par. Incuber pendant 5-10 minutes à température ambiante (RT). Pendant ce temps, préparer le mélange de transfection de plasmide.
2. Mélange de transfection plasmidique: Préparez le cocktail de transfection plasmidique dans 50 ul de médias OptiMEM. Nous utilisons habituellement 1 ug de chaque ADN plasmidique par la grippe sauvetage. Ajouter 1 pl des plasmides PDZ (à 1 ug / ul) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M et NS dans un tube contenant 50 ul de médias OptiMEM.
3. OptiMEM-LPF2000 ADN plasmidique mélange: Ajouter 250 pi de l'étape 1.1 dans le mélange d'ADN plasmidique de la grippe de transfection (étape 1.2). Incuber ce mélange pendant 20-30 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, préparer des suspensions de cellules 293T et MDCK pour la transfection.
4. Préparation de la co-culture 293T/MDCK: Avant de commencer, mettre le PBS 1X, DMEM 10% FBS 1% PS médias, et de l'EDTA-trypsine mélange à 37 ° C. La densité des cellules doit être à 80-90% de confluence le jour de la transfection. Habituellement, un plat de 100 mm confluents du 293T et un plat de 100 mm confluentes de cellules MDCK peuvent être utilisés pendant 10-12 sauvetages. Nous allons utiliser 250 pl de cellules par puits. Les deux lignées cellulaires seront remises en suspension dans un total de 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1%.
   • Soigneusement resuspendre chaque lignée cellulaire dans 10 ml de DMEM 10% FBS PS 1% dans un tube à centrifuger de 15 ml. Vous aurez un tube de cellules 293T et un tube de cellules MDCK.
   • Resuspendre les cellules 293T dans 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1% et quand resuspendues, livrer les 3 ml pour les cellules MDCK pour resuspendre ces cellules. Cela vous donnera le mélange de cellules 293T et MDCK à utiliser pour vos co-culture.
   • Ajouter 250 ul de cellules par puits 293T/MDCK (10-12 6 puits puits).
5. Après 20-30 minutes d'incubation RT (étape 1.3), ajouter 1 ml de DMEM 10% FBS PS 1% à le mélange d'ADN OptiMEM-LPF2000-grippe plasmide.
6. Ajouter le ml 1.3 (étape 1.5) dans les puits avec les 250 ul de cellules 293T/MDCK (étape 1.4).
7. Secouez la 6-bien-assiette et laisser incuber l'transfection nuit (ON) dans l'incubateur à 37 ° C et CO ₂ 5%.
8. Le lendemain, environ 16-24 heures post-transfection, changer le support de transfection et incuber les cellules transfectées dans BA DMEM 0,3% à 1% PS contenant 1 ug / ml de trypsine TPCK pendant 48 heures.
9. Après 48 heures de l'évolution des médias, le transfert du surnageant des cellules transfectées dans un microtube.
10. Centrifuger le surnageant de culture de tissu dans une microcentrifugeuse pendant 1-2 minutes, 13000 rpm.
11. Infect frais cellules MDCK en plaques 6 puits (plaqué la veille) ou des oeufs de poulet de 10 jours, âgé de embryonnés avec 200 pi de centrifugé surnageants de culture tissulaire de l'étape 1.10. Incuber les cellules et / ou des œufs à 37 ° C pendant 2-3 jours.
    1. L'infection des œufs de poule de 10 jours, âgé de embryonnés: Toutes les procédures d'infecter les œufs de poule embryonnés sont effectuées dans des conditions stériles.
       1. Bougie des oeufs de 10 jours en utilisant une vieille boîte à lumière-mirage de voir l'interface entre le sac d'air et de la cavité allantoïdienne. Faire une marque au crayon sur la frontière de l'interface.
       2. Avec une aiguille seringue de 5 ml faire un trou dans la coquille.
       3. Avec une seringue de 1 ml, d'infecter chaque oeuf avec 200 pi des surnageants de culture tissulaire de l'étape 1.10.
       4. Couvrir le trou dans la coquille d'oeuf avec de la cire fondue en utilisant un coton-tige.
       5. Incuber les œufs infectés à 37οC pendant 2-3 jours.
    2. L'infection de nouvelles cellules MDCK: Le jour avant le passage du surnageant de culture tissulaire de la 293T/MDCK co-cultures, préPare plats plaque à 6 puits avec des cellules MDCK pour atteindre 80-90% de confluence lendemain. Habituellement, une plaque de culture confluente 100 mm de tissu peut être divisé en 6-8 puits. Laver les cellules deux fois avec du PBS 1X, trypsiniser et préparer les plaques à 6 puits. Secouez doucement la main les plaques afin d'avoir une distribution uniforme des cellules. Culture des cellules, ON, dans les 37 ° C incubateur, 5% de CO _2. Avant l'infection, vérifier les cellules sous le microscope pour confirmer une monocouche, puis procéder à l'infection:
       • Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS 1X.
       • Infecter avec l'ul 200 de centrifugé surnageants de culture tissulaire pendant 1 heure à température ambiante. Ne laissez pas les piles sèches. Rock the 6-bien la plaque toutes les 10 minutes.
       • Après 1 heure d'absorption virale, retirez le support de l'infection des cellules MDCK et ajouter 2 ml de DMEM BA de 0,3% à 1% PS contenant 1 ug / ml de trypsine TPCK.
       • A 48-72 heures après le passage, en fonction de l'efficacité de transfection et de la charge virale, un effet cytopathogène (ECP) sera observée dans les cellules MDCK infectées. CPE suggère un sauvetage réussi. Toutefois, un test HA (partie 2) doivent encore être effectués pour confirmer la présence du virus dans les surnageants de culture de tissus.
12. Récolte de liquide allantoïdien d'oeufs embryonnés de poulets infectés: Toutes les procédures de récolter le liquide allantoïdien d'œufs infectés sont effectuées dans des conditions stériles. Environ 8 à 12 ml de liquide allantoïdien peut être récoltée à partir de chaque œuf de 10 jours-old-infectés. Avant la récolte du liquide allantoïdien, incuber les oeufs de poulet pendant 2 heures (ou ON) à 4 ° C pour tuer l'embryon de poulet et de coaguler le sang.
    • Laver les coquilles avec de l'éthanol à 70% pour établir des conditions stériles.
    • Ouvrez l'œuf, avec soin, au cours de la cavité d'air en tapotant avec une cuillère. Retirer la coquille cassée avec l'aide de forceps.
    • Avec une aiguille de 1 ml, enlever la membrane allantoïdienne sans casser le jaune de l'œuf.
    • Stabiliser l'embryon de poulet avec une spatule pendant que vous guidez une pipette de 10 ml dans le liquide allantoïdien. Recueillir le liquide allantoïdien autant que possible dans un tube à centrifuger de 15 ml sur la glace dans un seau à glace sans se casser ou de recueillir toute de jaune de l'œuf. Utiliser un tube à centrifuger de 15 ml pour chaque oeuf.
    • Centrifuger pendant 5 minutes à 4 ° C et le transfert du fluide allantoïdien (sans prendre granulés de globules rouges) à un 15 nouveaux tubes de centrifugation ml.
    • Stocker les tubes contenant le liquide allantoïdien centrifugé à 4 ° C jusqu'à ce qu'ils soient vérifiés pour la présence de virus récupéré avec une hémagglutination (HA) de dosage.

2. Dosage de HA pour confirmer le sauvetage des virus grippaux recombinants

Test d'hémagglutination (HA) est couramment utilisé pour détecter la présence du virus dans les cellules MDCK sauvé surnageants de culture des tissus et / ou le liquide allantoïdien d'œufs récoltés. Alternativement, des tests d'immunofluorescence (IFA) peut être également effectuée. Une fois un test identifie la présence du virus a sauvé, le virus doit être purifié sur plaque et de la composition génétique du virus sera confirmée par RT-PCR et séquençage.

La présence du virus dans les surnageants de culture de tissus MDCK et / ou dans le liquide allantoïdien d'œufs infectés peut être déterminé en utilisant macroscopiquement HA de poulet (ou autre source) des globules rouges (RBC). La présence du virus induit hémagglutination de RBC tandis que l'absence de virus permet la formation d'une pastille rouge dans le fond du puits (figure 4). Dans le cas du virus de la grippe, on croit qu'environ 10 ³ -10 ⁴ unités formant plaque (UFP) sont nécessaires pour donner un signal positif dans le dosage de HA, par conséquent, une PRI peut être effectuée en parallèle avec le dosage de HA pour confirmer un résultat vrai négatif. IFA avec primaire des anticorps anti-grippe est plus sensible que le test HA car moins de 103 à 104 virus peuvent être détectés avec cette technique. Il est possible que les surnageants ou liquide allantoïdien qui sont HA-négatifs sont positifs par IFA. Dans ce cas, le virus doit être amplifié par passage, à nouveau, dans les cellules MDCK ou des œufs. Liquide allantoïdien et / ou de surnageants de culture de tissus provenant du second passage doit désormais être clairement positif dans le test HA.

Dosages HA sont réalisées en V-bottom plaques de 96 puits. Négative (par exemple, PBS 1X) et positive (surnageants de culture des tissus et / ou liquide allantoïdien d'une infection par le virus de la grippe) des échantillons de contrôle doivent toujours être inclus dans tout dosage HA pour le valider.

• Déposer 50 ul de PBS 1X dans chaque puits de la V-96 puits à fond plat.
• Ajouter 50 ul dules surnageants MDCK culture de tissus et / ou liquide allantoïdien d'œufs infectés du pour le bien premier et, faire deux dilutions successives pour les puits suivants. Jeter le surplus de 50 ul du puits dernier.
• Ajouter 50 ul de 0,5% -1,0% de cellules rouges du sang de poulet (préparé dans du PBS 1X) à chaque puits.
• Incuber le V-96 puits à fond plat pendant 30-45 minutes (jusqu'à ce qu'un point rouge est visible au fond d'un échantillon de PBS témoin négatif) sur la glace. Lisez et interpretate les résultats comme indiqué dans la figure 4.

3. Passage de surnageants de culture de tissus

Un résultat négatif dans le test HA peut être le résultat de l'efficacité de transfection faible avec de faibles niveaux de virus présent être dans le surnageant de culture tissulaire et / ou liquide allantoïdien. Passage de ces échantillons dans des œufs frais MDCK et / ou embryonnés permettra l'amplification du virus (comme indiqué dans la figure 3) Les infections sont réalisées comme précédemment décrit dans la section 1.11.2.

4. Les résultats représentatifs

Le succès de secours virus de la grippe sera confirmée par la présence d'un dosage de HA positifs (figure 4). De plus, l'existence de CPE dans les cellules infectées avec le surnageant de culture de tissus ou avec le liquide allantoïdien d'oeufs proposera un sauvetage viral positif.

Figure 1. Structure de virus de la grippe: le virus de la grippe est entouré par une bicouche lipidique contenant les deux glycoprotéines virales (HA, NA) et, également, la protéine du canal ionique M2. HA est la protéine de fixation virale, responsable de la liaison à l'acide sialique contenant des récepteurs. NA est responsable de la libération viral à partir de cellules hôtes. Sous la bicouche lipidique, est une protéine de la couche composée de la protéine de matrice surface de l'enveloppe interne 1, M1, qui joue un rôle dans l'assemblage et le bourgeonnement du virion et la protéine nucléaire exportation (NEP), requise pour l'exportation nucléaire de ribonucleocapsids virale. Le noyau du virus est constitué d'une ribonucléoprotéine (RNP) complexe, composé de 8 à simple brin d'ARN négatif gènes viraux encapsidé par la nucléoprotéine virale NP. Associé avec le complexe RNP sont les virale ARN-dépendante ARN polymérase sous-unités PA, PB1, PB2 et. Les protéines non structurales NS1 et PB1-F2, codées par des segments d'ARN du NS et PB1, respectivement, ne font pas partie de la structure du virion.

Figure 2. Plasmides grippe sauvetage du virus: Le virus de la grippe huit gènes clonés dans le plasmide ambisens PDZ sont indiqués. plasmidique PDZ ^6, dérivé du plasmide d'expression de protéines pCAGGS ^7, est un vecteur plasmidique bidirectionnelle avec un ARN polymérase humaine, je promoteur et une séquence de terminaison de souris qui code l'ARN génomique négative sens; en orientation opposée à la polymérase I unir, une polymérase II cassette de transcription (poulet β-actine promoteur et polyA) code pour les protéines virales à partir du même gène viral. ADNc de chaque segment viraux sont générés par RT-PCR avec des amorces avant et arrière contenant le site de Sapi endonucléase de restriction et les régions non codantes de chaque segment (boîtes noires à l'extrémité des gènes viraux). Le produit de PCR est cloné dans le PDZ digéré par Sap-I.

Figure 3. Huit à base de plasmide système de sauvetage de la grippe: les plasmides contenant les gènes PDZ 8 virus de la grippe sont co-transfectées, en suspension, en 293T-MDCK cellules co-cultures (jour 1). Vingt-quatre heures après la transfection, les médias sans FBS, mais contenant TPCK / trypsine est remplacée (jour 2). Quarante-huit heures après avoir changé les médias, surnageant de culture tissulaire est récolté et utilisé pour infecter des cellules MDCK ou 10 jours d'âge des œufs de poule embryonnés (jour 4). 48-72 heures post-amplification, les surnageants de culture de tissus provenant MDCK cellules infectées ou le liquide allantoïdien d'œufs sont récoltés et analysés pour la présence du virus par HA (jour 6). Si aucun virus n'est détecté, les surnageants mêmes et / ou liquide allantoïdien peut être re-passages en cellules MDCK fraîches et / ou des œufs embryonnés.

Figure 4. L'hémagglutinine dosage (HA): Hémagglutination de RBC par particule virale est visible macroscopiquement et est la base pour détecter les particules virales dans le surnageant de culture de tissus et / ou liquide allantoïdien. Bien que le dosage de HA ne fait aucune discrimination entre les particules virales qui sont infectieux et les particules qui sont dégradées et ne sont plus en mesure d'infecter les cellules, le dosage est un bon indicateur de présence de virus dans des échantillons. A) l'absence (en haut) de la présence (en bas) du virus dans les échantillons biologiques est déterminée par la présence de RBC dans le fond de l'assiette ou de leur absence, respectivement. B) Un résultat représentatif à partir d'un dosage de HA avec aucune des niveaux détectables de virus (en haut) ou la présence (en bas) du virus est montré.

Discussion

Sauvetage des virus grippaux recombinants de l'ADN plasmidique est un processus simple et direct une fois le protocole est systématiquement réalisée dans le laboratoire, mais au début, de multiples choses peuvent aller mal. Il est impératif d'avoir une bonne préparation de plasmide pour générer le virus. Un bon entretien des lignées cellulaires (293T et MDCK) est crucial pour un sauvetage réussi virale. Traditionnellement, un marqueur génétique est inséré dans une gène de la grippe plasmide codant, par mutagénèse silencieuse. L'introduction de cette mutation silencieuse (s) et création d', par exemple, un site d'enzyme de restriction est roman permet de distinguer de type sauvage et le virus grippaux recombinants par digestion enzymatique. Par conséquent, après une amplification de la plaque purifiée virus recombinant, RT-PCR et séquençage des approches doivent être effectués pour vérifier la nature du virus sauvé. Le développement de ces techniques de génétique inverse et de sauvetage réussie de virus grippaux recombinants à partir de plasmides vous permettra de répondre à des questions spécifiques sur la biologie du virus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.