质粒DNA重组流感病毒的一代

Summary

质粒DNA的A型流感病毒的救援是一个基本的和必要的实验技术，使流感的研究人员，以产生重组病毒在流感病毒的生物学特性研究的多个方面，被视为潜在的载体或疫苗使用。

Abstract

多项流感研究小组的努力已在A型流感病毒反向遗传学的发展和改善的关键。成立于1999年

Protocol

1。流感病毒救援转

A型流感病毒属于负链RNA包膜病毒的 Orthomyxoviridae家庭。 A型流感病毒的基因组由8个不同的RNA负极的基因编码，至少11病毒蛋白（图^1） 4。在这份报告中，我们将重点抢救其中一个最常见的实验室菌株，使用含8流感病毒A/PR/8/34段ambisense质粒（PDZ）流感^{A/PR/8/34，5} （图2）。

对于抢救质粒DNA的重组流感病毒，我们建议3个独立的转染各重组病毒。如果一个以上的重组病毒救援尝试，规模以下步骤accordantly病毒的数量，被救出。下面的转染和感染协议是建立6孔板。该协议的一个示意图如图3所示。

1. OptiMEM脂质体2000（LPF2000）混合物：准备OptiMEM媒体和6-8 LPF2000每转液250μL。孵育5-10分钟，在室温（RT）。同时，准备质粒转染混合物。
2. 质粒转染混合物：准备在50μLOptiMEM媒体的质粒转染的鸡尾酒。我们通常使用1微克每个流感DNA质粒每救援。 PDZ质粒1μL（1微克/微升）PB2，PB1，PA，HA，NP，NA，M，和NS添加到管内含有50μLOptiMEM媒体。
3. OptiMEM LPF2000 - DNA质粒混合物：步骤1.1添加到流感DNA质粒转染混合物（步骤1.2）250μL。孵育这种混合物在室温下20-30分钟。同时，准备转染293T和MDCK细胞悬浮液。
4. 293T/MDCK共培养制备方法：在开始之前，带来的PBS 1X DMEM培养液10％胎牛血清的1％PS媒体，EDTA -胰蛋白酶的混合物至37 ° C。细胞的密度应在80％-90％汇合转染的一天。通常，一个融合100毫米293T和MDCK细胞融合100毫米盘菜可用于10-12抢救。我们将要使用的细胞，每孔250μL。这两种细胞株，将3 ml DMEM培养液10％胎牛血清的1％PS中的总悬浮在一个。
   • 在15 mL离心管中，小心地重新悬浮在10毫升的DMEM 10％胎牛血清的1％PS的每个细胞株。你将拥有一个MDCK细胞293T细胞和单管的管。
   • 重悬在3毫升的DMEM 10％胎牛血清的1％PS 293T细胞重悬于时，提供3毫升MDCK细胞，这些细胞重悬。这会给你的使用您的合作文化293T和MDCK细胞的混合物。
   • 加入250μL每口井的293T/MDCK细胞（10-12 6井井）。
5. 20-30分钟RT潜伏期（1.3步）后，添加1毫升的DMEM 10％胎牛血清的1％PS OptiMEM - LPF2000流感DNA质粒混合物。
6. 入井293T/MDCK细胞250μL（步骤1.4）中加入1.3毫升（1.5步）。
7. 轻轻摇动6板，让转染孵育过夜（ON），在孵化器在37 ° C和5％的_CO 2 。
8. 第二天，转染后约16-24小时，改变转染介质，并培育转染细胞48小时的PS含有1微克/毫升TPCK -胰蛋白酶的DMEM 1％，0.3％BA。
9. 不断变化的媒体48小时后，从转染细胞转移到离心管上清液。
10. 离心机在离心1-2分钟，13000转的组织培养上清。
11. 新鲜的MDCK细胞在6孔板（镀的前一天），或10日龄鸡胚步骤1.10离心组织培养上清液与200μL感染。在37细胞和/或蛋° C孵育2-3天。
    1. 10日龄鸡胚感染的所有程序感染鸡鸡胚在无菌条件下进行。
       1. 蜡烛的10日龄蛋使用光烛盒看到空气囊和尿囊腔之间的接口。制作一个界面上的边界的铅笔标记。
       2. 有了一个5毫升的注射器针头，使蛋壳中的孔。
       3. 用1 ml注射器，每个鸡蛋200μL1.10步骤的组织培养上清感染。
       4. 盖在融化的蜡，用棉签蛋壳的孔。
       5. 在37οC培养2-3天，受感染的鸡蛋。
    2. 新鲜MDCK细胞的感染：通过前一天从组织培养上清的293T/MDCK共培养，预削减6盘菜，与MDCK细胞达到80％-90％汇合第二天。通常情况下，一个融合的100毫米的组织培养板，可分成6-8井。洗细胞两次，用PBS 1X，trypsinize，并准备在6孔板。用手轻轻摇动板才能有一个细胞的军装分布。培养的细胞，在37 ° C培养箱中培养，5％的CO _2。感染前，检查在显微镜下的细胞，以确认单层，然后，继续与感染：
       • 洗涤细胞两次，用1毫升的PBS 1X。
       • 在室温下1小时与200μL离心组织培养上清感染。不要让干细胞。岩石6板，每10分钟。
       • 病毒吸收1小时后，取出从MDCK细胞的感染媒体和添加2毫升的DMEM 0.3％BA 1％的PS含1微克/毫升TPCK -胰蛋白酶。
       • 通过后48-72小时，取决于转染效率和病毒载量，细胞病变效应（CPE）将在MDCK细胞感染的细胞中观察到。 CPE建议抢救成功。然而，房委会法（第2）应进行确认病毒在组织培养上清中存在。
12. 收获从被感染的鸡鸡胚尿囊液的所有程序，从被感染的鸡蛋收获尿囊液，无菌条件下进行。从每10日龄感染的鸡蛋，约8-12毫升的尿囊液可收获。之前收获的尿囊液，2个小时的鸡蛋（或）孵育4 ° C至杀死鸡胚胎和凝固的血。
    • 用70％乙醇清洗蛋壳建立无菌条件。
    • 打开鸡蛋，仔细，在用勺子窃听的空气腔。与产钳的帮助下取出的碎蛋壳。
    • 用1毫升的针，不打破鸡蛋的蛋黄取出尿囊膜。
    • 稳定抹刀鸡胚你指导的尿囊液10毫升吸管。收集到尽可能多尿囊液15 mL离心管中，在不破坏或收集鸡蛋蛋黄中的任何一个冰桶冰。使用15 mL离心管中，每一个鸡蛋。
    • 离心5分钟，在4 ° C和尿囊液（没有考虑颗粒的红血细胞）转移到一个新的15 mL离心管。
    • 行管离心的尿囊液在4 ° C，直到他们获救病毒血凝（HA）检测与检查。

2。房委会的检测，以确认重组流感病毒救援

血凝试验（HA）是经常用来检测获救病毒在MDCK细胞组织培养上清和/或尿囊液的收获鸡蛋的存在。另外，也可进行免疫荧光测定（IFA）的。一旦检测发现获救病毒的存在，病毒应斑块纯化病毒的遗传组成，将通过RT - PCR和测序证实。

MDCK组织培养上清和/或在从被感染的鸡蛋的尿囊液中的病毒可以宏观使用房委会的鸡（或其他来源），红细胞（RBC）的决定。病毒诱导的红细胞血凝而没有病毒的情况下允许在井底的红色颗粒（图4）的形成。在流感病毒的情况下，它是认为， ^{大约10 3} -10 4菌斑形成单位（PFU）需要一个积极的信号，在房委会检测，因此，可以进行独立财务顾问与房委会平行检测，以确认一个真正的负面结果。 IFA是主要的抗流感抗体比HA检测更敏感，因为少于103-104病毒可以用这种技术检测。它可能比上清或尿囊液，HA阴性阳性的IFA。在这种情况下，病毒应该由传代扩增，再次，在MDCK细胞或鸡蛋。尿囊液和/或从第二代的组织培养上清现在应该在房委会的分析显然是积极的。

医管局的检测进行了V型底96孔板。负的（例如，PBS 1X）和积极的（组织培养上清和/或流感病毒感染的尿囊液）控制​​样品应始终包含在任何HA实验来验证它。

• 免除到每个96孔板的V型底部以及50μL的PBS 1X。
• 加入50μLMDCK细胞组织培养上清和/或尿囊液，从被感染的鸡蛋的第一口井，让下面的井的2倍连续稀释。丢弃从过去以及额外的50μL。
• 添加0.5％-1.0％鸡红细胞（1X的PBS配制），每孔50μL。
• 在冰上孵育底部的V - 96井板（30-45分钟，直到一个红点在PBS阴性对照样品的底部可见）。阅读和interpretate如在图4所示的结果。

3。通道的组织培养上清液

一个在房委会检测阴性结果可能是组织培养上清和/或尿囊液病毒在目前的水平低的转染效率低的结果。通过这些样本将允许在新鲜的MDCK细胞和/或鸡胚病毒的扩增（如图3所示）感染是因为以前在1.11.2节所述的执行。

4。代表性的成果

积极的HA检测（图4）的存在将被证实成功的流感病毒救援。此外，在感染的细胞与组织培养上清或从尿囊液蛋中存在的CPE将建议一个积极的病毒救援。

图1。流感病毒的结构：流感病毒是含有两种病毒糖蛋白（HA，NA），脂质双层包围，离子通道蛋白，M2 。房委会是病毒附着蛋白，唾液酸结合含有受体。 NA是病毒从宿主细胞释放。下面的脂质双分子层，是一种蛋白质层，内表面信封基质蛋白1，货币供应量M1，它起着的作用，在病毒粒子的组装和出芽和核出口蛋白（NEP），病毒ribonucleocapsids的核出口所需组成。病毒的核心是由一个核糖核蛋白（RNP）复杂，组成8个单股负RNA病毒基因的病毒的核蛋白，NP encapsidated。 RNP的复杂的病毒RNA依赖的RNA聚合酶亚基的PA，PB1，和PB2。非结构蛋白NS1和PB1 - F2，NS和PB1的RNA片段，分别编码，是不是病毒粒子的结构的一部分。

图2。流感病毒拯救质粒：8个流感病毒基因的克隆到质粒PDZ ambisense表示。 PDZ质粒^6，从蛋白的表达质粒pCAGGs ⁷派生，是一个双向的，人类的RNA聚合酶启动子和鼠标终止序列，编码的负面意义上的基因组RNA的质粒载体;在相反的方向，我团结的聚合酶，聚合酶II转录卡带（鸡β-肌动蛋白启动子和多聚腺苷酸）从相同的病毒基因编码的病毒蛋白。每个病毒段全长cDNA生成包含SAPI的限制性内切酶位点和各段的非编码区（在病毒基因年底的黑盒子）的正向和反向引物通过RT - PCR。 PCR产物克隆到与SAP，我消化的PDZ。

图3。 8质粒为基础的流感救援系统：包含8个流感病毒基因的PDZ质粒共同转染，在悬挂在293T - MDCK细胞共培养（1天）。二十四小时转染后，媒体没有胎牛血清，但含有TPCK /胰蛋白酶被替换（2天）。四十八小时后，媒体的变迁，组织培养上清收获和用于感染MDCK细胞或10日龄鸡胚（4天）。放大后48-72小时，从感染MDCK细胞或卵尿囊液的组织培养上清的收获，检测病毒的存在HA（6天）。如果没有检测到病毒，相同的上清和/或尿囊液，可以重新传代到新鲜的MDCK细胞和/或鸡胚。

图4。血凝试验（HA）：红细胞血凝病毒粒子是肉眼可见，是基础，以组织培养上清或/和尿囊液中检测病毒颗粒。虽然不区分病毒颗粒，具有传染性和退化，不再能够感染细胞的颗粒，医管局检测，检测样品中病毒的存在是一个良好的指标。一）不存在病毒在生物样品（底部）（顶），是由红细胞的存在，在盘底或他们的缺席，RESPectively。 B）病毒没有检测水平（顶部）或存在病毒（底部）代表房委会的检测结果显示。

Discussion

质粒DNA的重组流感病毒的救援是一个简单明了的过程，一旦该协议是经常在实验室中进行，但在开始的时候，多个事情都可能出错。生成的病毒，它必须有良好的质粒准备。正确保养的细胞株（293T和MDCK）是一个成功的病毒救援的关键。传统上，一个遗传标记是插入基因编码质粒流感，沉默突变。这种沉默突变（S）的简介和创作，例如，一个新的限制性内切酶站点是用来区分野生型和经酶切重组流感病毒。因此，扩增纯化的重组病毒的斑块后，RT - PCR和测序方法进行验证获救病毒的性质。这些反向遗传学技术和抢救成功的质粒重组流感病毒的发展，将让你回答有关病毒的生物学特性的具体问题。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.