プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Summary

プラスミドDNAからのインフルエンザウイルスの救助は、インフルエンザの研究者がインフルエンザウイルスの生物学のさまざまな側面を研究するために組換えウイルスを生成するために、そして潜在的なベクトルまたはワクチンとして使用することを可能にする基本的かつ本質的な実験的な手法です。

Abstract

インフルエンザ研究グループの数による努力はインフルエンザウイルスの逆遺伝学の発展と向上に極めて重要なされている。もともと1999年に設立さ

Protocol

1。インフルエンザウイルスの救助のトランスフェクション

インフルエンザウイルスは、負の鎖RNAエンベロープウイルスのオルトミクソウイルス科のファミリーに属する。インフルエンザは、ウイルスゲノムは、少なくとも、11のウイルスタンパク質（図^1）4をエンコードする負極性の8種類のRNAの遺伝子で構成されています。我々は（8インフルエンザA/PR/8/34ウイルスのセグメントを含むambisenseプラスミド（PDZ）を使用して最も一般的な実験室株、インフルエンザ^{A/PR/8/34、5}のうちの1つの救助に、このレポートでは、焦点を当てる図2）。

プラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスの救助のために、我々は、それぞれの組換えウイルスごとに3つの独立したトランスフェクションをお勧めします。複数の組換えウイルスの救助が試みられると、救出されるウイルスの数に一致して、次の手順を拡張する。以下のトランスフェクションと感染のプロトコルは、6ウェルプレートのために確立されます。プロトコルの概略図を図3に示します。

1. OPTIMEM -リポフェクタミン2000（LPF2000）混合：OPTIMEMのメディアとトランスフェクションあたりLPF2000の6-8μlを250μlを準備。室温（RT）で5〜10分間インキュベートする。一方、プラスミドトランスフェクション混合物を準備する。
2. プラスミドのトランスフェクション混合物：OPTIMEMメディアの50μlのプラスミドトランスフェクションのカクテルを準備。我々は通常、救助あたりのプラスミドを各インフルエンザのDNAの1μgを使用してください。 OPTIMEMメディア50μlを含むチューブに1 PDZプラスミドの溶液（1μg/μLの時）PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、およびNSを追加。
3. OPTIMEM - LPF2000 - DNAプラスミド混合物：インフルエンザのDNAプラスミドのトランスフェクション混合液（ステップ1.2）に、ステップ1.1から250μlを追加する。室温で20-30分のためにこの混合物をインキュベートする。一方、トランスフェクションのための293TとMDCK細胞の懸濁液を準備する。
4. 293T/MDCK共培養の準備：開始する前に、37にPBS 1X、DMEM 10％FBS 1パーセントPSメディア、およびEDTA -トリプシンの混合物をもたらす℃に細胞の密度は80〜90％コンフルエントでトランスフェクションの日でなければなりません。通常は、293TとMDCK細胞の一つコンフルエント100 mmディッシュの一つコンフルエントな100 mmディッシュは、救助10月12日に使用することができます。私たちは、ウェルあたりの細胞の250μlを使用するつもりです。両方の細胞株をDMEM 10％FBS 1パーセントPSの3mlの合計に再懸濁される。
   • 慎重に15 mlの遠心チューブでDMEM 10％FBS 1パーセントPSの10mlにそれぞれの細胞株を懸濁します。あなたは、293T細胞およびMDCK細胞用のチューブ用の管を持つこ​​とになります。
   • DMEM 10％FBS 1パーセントPS 3mlに293T細胞を再懸濁し、再懸とき、それらの細胞を再懸濁するために、MDCK細胞に3 mlを実現。これは、あなたの共培養に使用される293TとMDCK細胞の混合物を与える。
   • ウェルあたり293T/MDCK細胞（10-12 6ウェルウェル）250μlを添加する。
5. RTのインキュベーション（ステップ1.3）20〜30分後、OPTIMEM - LPF2000 -インフルエンザのDNAプラスミド混合液にDMEM 10％FBS 1パーセントPSの1 mlを加える。
6. 293T/MDCK細胞を250μl（ステップ1.4）でウェルに1.3ミリリットル（ステップ1.5）を追加します。
7. 穏やかに6ウェルプレートを振とうし、℃、5％CO ₂で37インキュベーターで一晩トランスフェクションインキュベートする（ON）ができます。
8. 翌日、約16-24時間後にトランスフェクションは、トランスフェクションのメディアを変更し、48時間TPCK -トリプシンのの1μg/ mlを含むPS DMEM 0.3％BAに1％をトランスフェクションされた細胞をインキュベートする。
9. メディアを変えるの48時間後に、マイクロ遠心チューブにトランスフェクションした細胞の上清を移す。
10. 1〜2分、13,000 rpmの遠心で組織培養上清を遠心してください。
11. 6ウェルプレート（前日に播種）またはステップ1.10〜遠心組織培養上清の200μlの10日齢の鶏孵化卵に新鮮なMDCK細胞に感染。 2〜3日で37細胞および/または卵° Cをインキュベートする。
    1. 10日齢の鶏孵化卵の感染：鶏孵化卵に感染するすべての手順は、無菌条件下で行われる。
       1. 気嚢と尿膜腔の間のインタフェースを確認するためにライトキャンドルボックスを使用して、10日齢の卵キャンドル。インタフェースの境界上で鉛筆のマークを付けます。
       2. 5 mlの注射針で卵殻に穴を開ける。
       3. 1mlのシリンジで、ステップ1.10〜組織培養上清の200μlで各卵に感染する。
       4. 綿棒を使用して、溶けたワックスと卵殻に穴をカバーする。
       5. 2〜3日間37οCで感染した卵をインキュベートする。
    2. 新鮮なMDCK細胞の感染：通過前日293T/MDCK共培養から組織培養上清、事前に皮をむくMDCK細胞を6ウェルプレートの料理翌日80-90％コンフルエントに到達する。通常、コンフルエントな100 mm組織培養プレートは6〜8ウェルに分割することができます。細胞を洗浄、二回、PBS 1Xで、トリプシン処理し、6ウェルプレートを準備。静かに細胞の均一な分布を持つために手でプレートを振る。文化のセル、ON、37℃インキュベーター、5％CO _2。感染する前に、単分子層を確認するために顕微鏡下で細胞をオンにし、感染を続行して下さい：
       • PBS 1X 1mlで、二回、細胞を洗浄。
       • 室温で1時間遠心分離した組織培養上清の200μlで感染する。細胞は乾燥させないでください。 6ウェルプレート10分ごとに揺らし。
       • ウイルス性吸収の1時間後、MDCK細胞から感染の媒体を削除し、TPCK -トリプシンのの1μg/ mlを含むPS DMEM 0.3％BA 1％2 mlを加える。
       • 通過後48〜72時間で、トランスフェクション効率とウイルスの負荷に応じて、細胞変性効果（CPE）はMDCK感染細胞で観察される。 CPEは、成功した救助を示唆している。しかし、HAアッセイ（セクション2）が依然として組織培養上清中のウイルスの存在を確認するために実行する必要があります。
12. 感染した鶏の孵化卵から収穫尿膜液：感染した卵から尿膜液を採取するすべての手順は、無菌条件下で行われる。尿膜腔液の約8〜12ミリリットルは、それぞれの10日齢に感染した卵から収穫することができる。尿膜液を採取する前に、℃でニワトリ胚を殺すと血液を凝固するために4で2時間（またはON）のために鶏の卵をインキュベートする。
    • 無菌状態を確立するために70％エタノールで卵の殻を洗ってください。
    • スプーンで軽くたたくことによって空気の空洞を介して、慎重に、卵を開きます。鉗子の助けを借りて、壊れた卵の殻を外します。
    • 1mlの針で、卵の黄身を壊すことなく、尿膜を取り除く。
    • あなたが尿膜液に10 mlのピ​​ペットをガイドとしてスパチュラでニワトリ胚を安定させます。壊したり、卵の卵黄のいずれかを収集せずに、氷のバケツに氷の上に15 mlの遠心管に、できるだけ多くの尿膜液として収集する。それぞれの卵のための15 ml遠心チューブを使用してください。
    • 4℃で5分間遠心し℃、新鮮な15 ml遠心管に尿膜腔液を（ペレット化赤血球を服用せずに）転送する。
    • それらは赤血球凝集（HA）アッセイによる救出、ウイルスの有無をチェックされるまで、4℃で遠心分離した尿膜液を含むチューブ℃で保管してください。

2。組換えインフルエンザウイルスの救助を確認するために、HAアッセイ

赤血球凝集アッセイ（HA）は、日常的にMDCK細胞培養上清及び/または収穫卵の尿膜腔液の救出、ウイルスの存在を検出するために使用されます。また、免疫蛍光アッセイ（IFA）も行うことができます。アッセイは、救出のウイルスの存在を識別する一度、ウイルスをプラーク精製されるべきであり、ウイルスの遺伝的組成は、RT - PCRおよび配列決定によって確認されます。

MDCK細胞の培養上清及び/または感染した卵から尿膜液中のウイルスの存在は、肉眼的に鶏のHA（または別のソース）赤血球（RBC）を用いて決定することができる。ウイルスの不在は、ウェルの底に赤ペレット（図4）の形成を可能にしながら、ウイルスの存在は、RBCの赤血球凝集を誘導する。インフルエンザウイルスの場合には、それは約10 ³ -10 ⁴プラーク形成単位（PFU）は、HAのアッセイで陽性信号を与えるために必要とされると考えられているので、IFAは、確認のため、HAアッセイと並行して行うことができます。真の陰性結果。未満103から104のウイルスはこの手法で検出できるので、一次抗インフルエンザ抗体を用いたIFAは、HAアッセイよりも感度が高いです。それはIFAで陽性のHA陰性である上清あるいは尿液より可能です。この場合、ウイルスはMDCK細胞で、卵で、再び、継代によって増幅されるべきである。第2流路から尿膜液および/または組織培養上清は、現在、HAアッセイで明らかな陽性でなければなりません。

HAアッセイは、V底96ウェルプレートで実施されています。負（例えば、PBS 1X）と正（組織培養上清及び/またはインフルエンザウイルスの感染から尿膜腔液）コントロールのサンプルは、常にそれを検証するために、任意のHAアッセイに含まれるべきです。

• V底96ウェルプレートの各ウェルにPBS 1Xの50μlを分注する。
• 50μlを加え感染した最初のウェルに卵と、からMDCK細胞の培養上清および/または尿膜液は、以下の井戸を2倍希釈系列を作る。最後のウェルからの余分な50μlを捨てる。
• 各ウェルに0.5％-1.0％ニワトリ赤血球（PBS 1Xで調製）を50μlを追加。
• 氷上で30-45分（赤い点は、陰性コントロールのPBS試料の底部に見えるようになるまで）のためのV底96ウェルプレートをインキュベートします。図4に示される結果を読んで、interpretate。

3。組織培養上清のパッセージ

HAアッセイで陰性の結果は、組織培養上清および/または尿膜液中のウイルスという存在の低水準と低いトランスフェクション効率の結果である可能性があります。新鮮なMDCKおよび/または孵化卵におけるこれらのサンプルの通過は、感染症は、以前は次のセクション1.11.2で説明したように実行されます（図3に示される）ウイルスの増幅が可能になります。

4。代表的な結果

成功したインフルエンザウイルスの救助は、正のHAアッセイ（図4）の存在によって確認される。さらに、組織培養上清、または卵から尿膜液と感染細胞におけるCPEの存在は肯定的なウイルスの救助を提案します。

図1。インフルエンザウイルスの構造：インフルエンザウイルスは、2つのウイルス糖タンパク質（HA、NA）と、また、イオンチャネル蛋白質、M2を含む脂質二重層に囲まれています。 HAは、シアル酸含有受容体に結合することの責任のウイルス付着タンパク質、です。 NAは、宿主細胞からのウイルスのリリースを担当しています。脂質二重層の下、ビリオンアセンブリと出芽およびウイルスribonucleocapsidsの核外輸送に必要な核輸出タンパク質（NEP）、の役割を果たしている内面のエンベロープのマトリックスタンパク質1、M1、から構成される蛋白質の層です。ウイルスのコアは、ウイルスの核タンパク質、NPでcapsidに包まれた8つのシングル鎖陰性RNAウイルスの遺伝子で構成される、リボ核タンパク質（RNP）複合体で作られています。 RNP複合体に関連付けられているウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットPA、PB1、PB2となります。非構造タンパク質NS1およびRNAのセグメントNSとPB1にコードされるPB1 - F2は、それぞれ、ビリオンの構造の一部ではありません。

図2。インフルエンザウイルスのレスキュープラスミド：8インフルエンザウイルスの遺伝子ambisenseプラスミドPDZにクローニングされたが示されている。 pCAGGs ⁷プラスミドタンパク質の発現から得られるプラスミドPDZ ^6は 、ヒトのRNAポリメラーゼIはプロモーターと負のセンスのゲノムRNAをコードするマウスターミネーター配列との双方向のプラスミドベクターであり、逆方向に私が団結ポリメラーゼに、ポリメラーゼII転写カセット（ニワトリβ-アクチンプロモーターとポリA）は、同じウイルスの遺伝子からウイルスタンパク質をコードしている。各ウイルスのセグメントからのcDNAは、SAPIの制限エンドヌクレアーゼ部位と各セグメントの非翻訳領域を含むフォワードプライマーとリバースプライマーを用いたRT - PCR（ウイルス遺伝子の端にある黒色のボックス）によって生成されます。 PCR産物は、SAP - Iで消化PDZにクローニングされています。

図3。八プラスミドベースのインフルエンザのレ ​​スキューシステム：8インフルエンザウイルスの遺伝子を含むPDZプラスミドを293T - MDCK細胞共培養（1日目）で、懸濁液に、同時トランスフェクトされています。二十四時間トランスフェクション後、FBSのないメディアがTPCK /トリプシンを含むが（2日目）に置き換えられます。四十八時間のメディアを変更した後、組織培養上清を回収し、MDCKまたは10日齢発育鶏卵を（4日目）に感染するために使用されます。 48〜72時間後の増幅、卵からMDCK感染細胞や尿膜腔液から組織培養上清は、HA（6日）で採取し、ウイルスの存在についてアッセイする。ウイルスが検出されない場合は、同じ上清および/または尿液は、新鮮なMDCK細胞および/または孵化卵に再継代することができます。

図4。赤血球凝集素分析（HA）：ウイルス粒子によるRBCの凝集は、肉眼で見えるであり、組織培養上清または/および尿液にウイルス粒子を検出するための基礎です。 HAアッセイは、ウイルス感染性粒子と劣化したと細胞に感染することはもはやできる粒子を区別しませんが、アッセイは、サンプル中のウイルスの存在の良い指標です。 A）生物学的サンプル中のウイルスの存在の不在（上）（下）は、プレートの底部におけるRBCの存在や彼らの不在、RESPによって決定されます。ectively。 B）HAのウイルスの検出可能なレベルの分析（上）またはウイルスの存在（下）から代表的な結果が示されています。

Discussion

プラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスの救助は、プロトコルが日常的に実験室で実施されると、シンプルかつ簡単なプロセスですが、初めに、複数の物事が間違って行くことができます。それは、ウイルスを生成するために適切なプラスミド調製を持つことが不可欠です。細胞株（293TとMDCK）の適切な維持管理が成功したウイルスの救助のための非常に重要です。伝統的に、遺伝タグはサイレント突然変異誘発によって、インフルエンザ遺伝子エンコーディングプラスミドに挿入されます。このサイレント変異（複数可）との創造の導入は、例えば、新たな制限酵素部位は、酵素消化により、野生型および組換えインフルエンザウイルスを区別するために使用されます。したがって、組換えウイルスをプラーク精製の増幅の後、RT - PCRおよびシークエンシングのアプローチは、救出、ウイルスの性質を検証するために実行する必要があります。これらの逆遺伝学技術とプラスミドから遺伝子組換えインフルエンザウイルスの成功救助の開発では、ウイルスの生物学に関する特定の質問に答えることができるようになります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.