Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Summary

Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.

Abstract

Los esfuerzos realizados por varios grupos de investigación de la gripe han sido fundamentales en el desarrollo y la mejora genética de la influenza A virus inversa. Originalmente establecida en 1999

Protocol

1. Virus de la gripe de rescate de la transfección

Influenza A virus pertenece a la familia Orthomyxoviridae de cadena negativa virus ARN envuelto. La gripe A genoma del virus consiste en ocho diferentes genes de ARN de polaridad negativa que codifican, al menos, 11 proteínas virales (Figura 1) ^4. Nos centraremos, en este informe, en el rescate de uno de la cepa de laboratorio más común, la gripe A/PR/8/34, ^{5 por medio de} plásmidos ambisense (PDZ), que contiene los 8 segmentos de la gripe A/PR/8/34 viral ( Figura 2).

Para el rescate de los virus de la influenza recombinante de ADN plásmido, se recomienda 3 transfecciones independientes para cada virus recombinante. Si más de un virus recombinante de rescate que se intenta, escala los siguientes pasos accordantly a la cantidad de virus para ser rescatados. La transfección siguientes y el protocolo de infección se ha establecido para los 6 y placas. Una representación esquemática del protocolo se ilustra en la Figura 3.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mezcla: Preparar 250 ml del medio OptiMEM y 8.6 l de transfección por LPF2000. Se incuba durante 5-10 minutos a temperatura ambiente (TA). Mientras tanto, prepare la mezcla de transfección del plásmido.
2. Mezcla de transfección del plásmido: Prepare el coctel de la transfección de plásmidos en 50 l de los medios de comunicación OptiMEM. Por lo general, el uso de cada uno 1 mg de ADN plásmido por influenza rescate. Añadir 1 l de los plásmidos PDZ (a 1 mg / l) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, y NS a un tubo que contiene 50 l de los medios de comunicación OptiMEM.
3. OptiMEM-LPF2000 ADN plásmido mezcla: Añadir 250 l de paso 1.1 en la mezcla de ADN del plásmido de transfección de la gripe (paso 1.2). Incubar la mezcla durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, preparar suspensiones de células 293T y MDCK para la transfección.
4. Preparación de 293T/MDCK co-cultivo: Antes de comenzar, lleve el 1X PBS, DMEM 10% de SFB al 1% los medios de comunicación PS, y la mezcla de EDTA-tripsina a 37 º C. La densidad de las células deben estar en 80-90% de confluencia del día de la transfección. Por lo general, un plato de 100 mm confluente de 293T y un plato de 100 mm confluente de células MDCK se puede utilizar para 10-12 rescates. Vamos a utilizar 250 l de células por pocillo. Ambas líneas celulares se resuspendieron en un total de 3 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS.
   • Cuidadosamente resuspender cada línea celular en 10 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS en un tubo de centrífuga de 15 ml. Usted tendrá un tubo de células 293T y un tubo de células MDCK.
   • Resuspender las células 293T en 3 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS, y cuando volvieron a suspender, entregar el 3 ml a las células MDCK para volver a suspender las células. Esto le dará la mezcla de células MDCK y 293T que se utilizará para sus compañeros de la cultura.
   • Añadir 250 l de las células 293T/MDCK por pozo (10-12 de 6 y pozos).
5. Después de 20-30 minutos de incubación RT (paso 1.3), añadir 1 ml de DMEM 10% de SFB 1% PS a la mezcla de OptiMEM-LPF2000-influenza ADN del plásmido.
6. Agregue el 1,3 ml (paso 1.5) en los pozos con el 250 l de células 293T/MDCK (paso 1.4).
7. Agite con cuidado el 6-y-placa y dejar que la transfección de incubar durante la noche (ON) en la incubadora a 37 ° C y CO ₂ al 5%.
8. Al día siguiente, aproximadamente 16-24 horas después de la transfección, cambiar el soporte de la transfección y se incuban las células transfectadas en Buenos Aires DMEM 0,3% al 1% PS con 1 mg / ml de TPCK-tripsina durante 48 horas.
9. A las 48 horas del cambio de los medios de comunicación, la transferencia del sobrenadante de las células transfectadas en un tubo de microcentrífuga.
10. Centrifugar el sobrenadante de cultivo de tejidos en una microcentrífuga durante 1-2 minutos, 13.000 rpm.
11. Infectar nuevas células MDCK en placas de 6 pocillos (plateado el día antes) o 10 días de edad huevos embrionados de pollo con 200 l de centrifugado sobrenadantes de cultivo de tejidos a partir del paso 1.10. Se incuban las células y / o los huevos a 37 ° C durante 2-3 días.
    1. La infección de los huevos de pollo de 10 días de edad embrionados: Todos los procedimientos para infectar los huevos de gallina embrionados se llevan a cabo en condiciones estériles.
       1. Vela los huevos de 10 días de edad, con una caja de luz, mirar al trasluz para ver la interfaz entre la cámara de aire y de la cavidad alantoidea. Haga una marca de lápiz en la frontera de la interfaz.
       2. Con una aguja de la jeringa de 5 ml hacer un agujero en la cáscara del huevo.
       3. Con una jeringa de 1 ml, infectan cada huevo con 200 l de los sobrenadantes de cultivo de tejidos a partir del paso 1.10.
       4. Cubrir el agujero en la cáscara del huevo con cera fundida utilizando un hisopo de algodón.
       5. Incubar los huevos infectados en 37οC durante 2-3 días.
    2. La infección de nuevas células MDCK: El día antes de la aprobación del sobrenadante del cultivo de tejido de la 293T/MDCK co-cultivos, prePare de 6 pocillos placa con células MDCK para llegar a 80-90% de confluencia día siguiente. Por lo general, un confluente 100 mm placa de cultivo de tejidos se puede dividir en 6-8 pozos. Lavar las células dos veces con PBS 1X, trypsinize y preparar las placas de 6 pocillos. Agite suavemente con la mano las placas con el fin de tener una distribución uniforme de las células. Cultivo de las células, ON, en la incubadora de 37 ° C, 5% de CO _2. Antes de la infección, consulte las células bajo el microscopio para confirmar una monocapa, y luego, proceder a la infección:
       • Lavar las células dos veces con 1 ml de PBS 1X.
       • Infectar con el l 200 de centrifugado sobrenadantes de cultivo de tejidos durante 1 hora a temperatura ambiente. No deje que las pilas secas. Rock the 6-y-placa cada 10 minutos.
       • Después de 1 hora de la absorción viral, retire el soporte de la infección de las células MDCK y añadir 2 ml de DMEM BA 0,3% al 1% PS con 1 mg / ml de TPCK-tripsina.
       • A las 48-72 horas después de la aprobación, en función de la eficiencia de transfección y la carga viral, un efecto citopático (CPE) se observó en las células infectadas MDCK. CPE propone un rescate exitoso. Sin embargo, un ensayo de HA (sección 2), aún se debe realizar para confirmar la presencia del virus en el sobrenadante de cultivo de tejidos.
12. Fluido alantoideo de cosecha de huevos de gallina embrionados infectados: Todos los procedimientos para la cosecha del líquido alantoideo de los huevos infectados se llevan a cabo en condiciones estériles. Aproximadamente 8-12 ml de fluido alantoideo se puede cosechar a partir de cada huevo de 10 días de edad por el VIH. Antes de la recolección del líquido alantoideo, se incuban los huevos de gallina durante 2 horas (u ON) a 4 ° C para matar a los embriones de pollo y la coagulación de la sangre.
    • Lave las cáscaras de huevo con etanol al 70% para establecer las condiciones de esterilidad.
    • Abrir el huevo, con cuidado, sobre la cavidad de aire golpeando con una cuchara. Retire la cáscara de huevo roto con la ayuda de fórceps.
    • Con una aguja de 1 ml, quitar la membrana alantoidea sin romper la yema del huevo.
    • Estabilizar el embrión de pollo con una espátula en la conducción de una pipeta de 10 ml en el líquido alantoideo. Recoger la mayor cantidad de líquido alantoideo como sea posible en un tubo de centrífuga de 15 ml en hielo en un cubo de hielo sin romper o el cobro de cualquiera de la yema del huevo. Utilizar un tubo de centrífuga de 15 ml por cada huevo.
    • Centrifugar durante 5 minutos a 4 ° C y la transferencia del líquido alantoideo (sin gránulos de glóbulos rojos) a un nuevo tubos de 15 ml centrífuga.
    • Guarde los tubos que contienen el líquido alantoideo se centrifuga a 4 ° C hasta que se comprueba la presencia de virus rescatado con una hemaglutinación (HA) de ensayo.

2. HA ensayo para confirmar el rescate de los virus de la influenza recombinante

Ensayo de hemaglutinación (HA) se utiliza rutinariamente para detectar la presencia de virus rescatado en MDCK sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o el líquido alantoideo de los huevos cosechados. Por otra parte, los ensayos de inmunofluorescencia (IFA) también se puede ajustar. Una vez que un ensayo identifica la presencia de virus rescatado, el virus se purificaron en placa y la composición genética del virus se confirmó mediante RT-PCR y secuenciación.

La presencia del virus en el sobrenadante de cultivo de tejidos MDCK y / o en el líquido alantoideo de los huevos infectados se puede determinar macroscópicamente con HA de pollo (u otra fuente) los glóbulos rojos (RBC). La presencia del virus induce hemaglutinación de glóbulos rojos, mientras que la ausencia de virus permite la formación de una bolita roja en el fondo del pozo (Figura 4). En el caso de los virus de la influenza, se cree que aproximadamente 10 ³ -10 ⁴ unidades formadoras de placas (UFP) están obligados a dar una señal positiva en el ensayo de HA, por lo tanto, una alternativa de huida se puede realizar en paralelo con el ensayo de hemaglutinación para confirmar un resultado negativo verdadero. IFA con primaria de anticuerpos anti-influenza es más sensible que la prueba de HA, ya menos de 103 a 104 virus puede ser detectado con esta técnica. Es posible que los sobrenadantes o fluidos alantoideo que HA-negativos son positivos por el IFA. En este caso, el virus debe ser amplificada por pases, de nuevo, en células MDCK o en huevos. Fluido alantoideo y / o sobrenadantes de cultivo de tejidos a partir de ahora el segundo paso debe ser claramente positivos en el ensayo de HA.

HA ensayos se llevan a cabo en el fondo en V de 96 pocillos. Negativos (por ejemplo, PBS 1X) y positivos (sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o fluido alantoideo de una infección de virus de la influenza) muestras de control siempre debe ser incluido en cualquier ensayo de HA para validarlo.

• Dispensar 50 l de PBS 1X a cada pocillo de la V-96 pocillos de fondo de placa.
• Añadir 50 l delos sobrenadantes tejido MDCK cultura y / o fluido alantoideo de los huevos infectados con el primer pozo y hacer 2 veces diluciones seriadas de los pozos siguientes. Deseche el extra de 50 l en el pozo pasado.
• Añadir 50 l de 0,5% -1,0% de células rojas de la sangre de pollo (preparado en PBS 1X) a cada pocillo.
• Incubar el fondo en V de 96 pocillos durante 30-45 minutos (hasta un punto rojo es visible en la parte inferior de un control negativo de la muestra PBS) sobre el hielo. Lea y interpretate los resultados como se indica en la Figura 4.

3. La aprobación de sobrenadantes de cultivo de tejidos

Un resultado negativo en la prueba de HA puede ser el resultado de la baja eficiencia de transfección con bajos niveles de virus presente que en los sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o fluido alantoideo. La aprobación de estas muestras de huevos frescos MDCK y / o embrionados permite la amplificación del virus (como se indica en la Figura 3) Las infecciones se llevan a cabo como se describió anteriormente en la sección 1.11.2.

4. Resultados representante

Rescate con éxito el virus de la gripe se confirma por la presencia de un ensayo de HA positivo (Figura 4). Además, la existencia de ECP en las células infectadas con el sobrenadante de cultivo de tejidos o con el fluido alantoideo de los huevos se sugiere un rescate viral positiva.

Figura 1. Estructura virus de la gripe: el virus de la gripe está rodeado por una bicapa lipídica que contiene dos glicoproteínas virales (HA, NA) y, también, la proteína del canal de iones, M2. HA es la proteína de unión del virus, responsables de la unión de ácido siálico, que contienen los receptores. NA es responsable de la liberación viral de las células huésped. Por debajo de la bicapa lipídica, es una capa de proteína compuesta por la proteína de la matriz sobre una superficie interior, M1, que desempeña un papel en virión montaje y en ciernes y la proteína nuclear de exportación (NEP), necesarios para la exportación nuclear de ribonucleocapsids viral. El núcleo del virus es de una ribonucleoproteína (RNP) compleja, compuesta de 8 de cadena simple negativa genes ARN viral encapsulada por la nucleoproteína viral, NP. Asociadas con el complejo RNP son los virus de ARN dependiente de ARN polimerasa subunidades PA, PB1, PB2 y. Las proteínas no estructurales, NS1 y PB1-F2, codificado por el ARN segmentos NS y PB1, respectivamente, no son parte de la estructura del virión.

Figura 2. Influenza virus de rescate plásmidos: Los genes de la gripe ocho virus clonado en el plásmido PDZ ambisense se indican. plásmido PDZ ^6, deriva de la expresión de la proteína del plásmido pCAGGs ^7, es un vector plásmido bidireccional con un ser humano la RNA polimerasa I promotor y una secuencia de terminación de ratón que codifica el ARN genómico de sentido negativo, en orientación opuesta a la de la polimerasa que se unen, una polimerasa II cassette de transcripción (pollo β-actina promotor y poliA) codifica las proteínas del virus del gen viral mismo. ADNc de cada segmento viral son generados por RT-PCR con cebadores directo e inverso que contiene la restricción endonucleasa Sapi sitio y las regiones no codificadoras de cada segmento (cajas de negro en el extremo de los genes virales). El producto de PCR se clona en el PDZ digerido con Sap-I.

Figura 3. De ocho a base de plásmidos influenza sistema de rescate: los plásmidos PDZ que contienen los genes 8 influenza viral son co-transfectadas, en suspensión, en las células MDCK-293T co-culturas (día 1). Veinticuatro horas después de la transfección, los medios de comunicación sin FBS, pero que contiene TPCK / tripsina se sustituye (día 2). Cuarenta y ocho horas después de cambiar los medios de comunicación, el sobrenadante de cultivo de tejidos se extrae y se usa para infectar los huevos embrionados MDCK o 10 días de edad-de pollo (día 4). 48-72 horas después de la amplificación, los sobrenadantes de cultivo de tejidos de las células infectadas MDCK o fluido alantoideo de los huevos se cosechan y se analizó la presencia de virus de HA (día 6). Si no se detecta virus, los sobrenadantes misma y / o fluidos alantoideo puede volverse a inocular en nuevas células MDCK y / o huevos embrionados.

Figura 4. Hemaglutinina ensayo (HA): hemaglutinación de glóbulos rojos por partículas de virus es visible macroscópicamente y es la base para detectar partículas virales en los sobrenadantes de cultivo de tejidos y / o fluidos alantoideo. Aunque el ensayo de HA no discrimina entre las partículas virales que son infecciosas y las partículas que son degradados y ya no es capaz de infectar las células, el ensayo es un buen indicador de la presencia del virus en las muestras. A) Ausencia (arriba) de la presencia (inferior) del virus en las muestras biológicas se determina por la presencia de glóbulos rojos en la parte inferior de la placa o su ausencia, respectively. B) Un resultado representativo de un ensayo de HA con niveles no detectables de virus (arriba) o presencia (inferior) del virus de la muestra.

Discussion

Rescate de los virus de la influenza recombinante de ADN plásmido es un proceso simple y sencillo una vez que el protocolo se realiza rutinariamente en el laboratorio, pero en un principio, varias cosas pueden salir mal. Es imprescindible tener una buena preparación de plásmidos para generar el virus. El mantenimiento adecuado de las líneas celulares (293T y MDCK) es crucial para el éxito de un rescate viral. Tradicionalmente, un marcador genético se inserta en un gen que codifica la gripe plásmido, mediante mutagénesis en silencio. La introducción de esta mutación silenciosa (s) y la creación de, por ejemplo, una restricción de la novela sitio de la enzima se utiliza para distinguir entre los de tipo salvaje y virus de la influenza recombinante por digestión enzimática. Por lo tanto, después de la amplificación de la placa de virus recombinante purificada, RT-PCR y secuenciación de los enfoques se debe realizar para verificar la naturaleza del virus rescatado. El desarrollo de estas técnicas de genética inversa y exitoso rescate de los virus de la influenza recombinante a partir de plásmidos le permitirá responder a preguntas específicas acerca de la biología del virus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.