Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Summary

Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.

Abstract

Grip araştırma grupları bir takım çabalar, influenza A virüsünün ters genetik geliştirme ve iyileştirme kilit edilmiştir. 1999 yılında kurulmuş.

Protocol

1. İnfluenza virüs kurtarma transfeksiyon

İnfluenza A virüsü negatif iplikli RNA zarflı virüs Orthomyxoviridae ailesine aittir. Influenza A virüs genomunun en az 11 viral proteinler (Şekil 1) ^4, kodlamak negatif polarite sekiz farklı RNA genleri oluşur. (8 grip A/PR/8/34 viral segmentleri içeren ambisense plazmid (pDZ) kullanarak en sık rastlanan laboratuvar suşu, grip A/PR/8/34, ⁵ kurtarma, bu raporda, durulacak Şekil 2).

Plazmid DNA rekombinant influenza virüslerinin kurtarılması için, biz her rekombinant virüs başına 3 bağımsız transfections tavsiye ederiz. Birden fazla rekombinant virüs kurtarma girişimi ise, kurtarılan virüslerin sayısı accordantly aşağıdaki adımları ölçekli. 6-iyi-plakalar için aşağıdaki transfeksiyon ve enfeksiyon protokolü ile kurulmuştur. Protokol şematik Şekil 3'te gösterilmiştir.

1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) karışımı: 250 ul OptiMEM medya ve LPF2000 başına transfeksiyon 6-8 ul hazırlayın. Oda sıcaklığında (RT) 5-10 dakika inkübe edin. Bu arada, plazmid transfeksiyon karışımı hazırlar.
2. Plazmid transfeksiyon karışımı: OptiMEM medya 50 ul plazmid transfeksiyon kokteyl hazırlayın. Biz genellikle 1 mg kurtarma ortalama plazmid her influenza DNA kullanın. 50 ul OptiMEM medya içeren bir tüp, 1 pDZ plazmid ul (1 mcg / ml) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, K, ve NS ekleyin.
3. OptiMEM-LPF2000 DNA plazmid karışımı: grip DNA plazmid transfeksiyon karışımı (adım 1.2) içine adım 1.1 'den 250 ul ekleyin. Bu karışımı 20-30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Bu arada, transfeksiyon için 293T ve MDCK hücre süspansiyonları hazırlayın.
4. 293T/MDCK ko-kültür hazırlanması: Başlamadan önce, 37 PBS 1X, DMEM% 10 FBS% 1 PS medya ve EDTA-tripsin karışımı getirmek ° C Hücrelerin yoğunluğu% 80-90 izdiham transfeksiyon günü olmalıdır. Genellikle, 293T ve MDCK hücreleri konfluent 100 mm çanak biri konfluent 100 mm çanak kurtarır 10-12 için kullanılan olabilir. Biz de her hücre 250 ul kullanmaya devam etmektedir. Her iki hücre hatları DMEM% 10 FBS% 1 PS 3 ml toplam yeniden süspanse olacaktır.
   • Dikkatlice DMEM% 10 FBS% 1 PS 10 ml, 15 ml santrifüj tüpüne her hücre hattı tekrar süspansiyon haline getirin. MDCK hücreleri için 293T hücreleri ve bir tüp bir tüp var.
   • DMEM% 10 FBS% 1 PS 3 ml 293T hücrelerinin yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse zaman, bu hücrelerin tekrar süspansiyon MDCK hücreleri 3 ml sunmak. Bu ko-kültür için kullanılacak 293T ve MDCK hücrelerin karışımı verecektir.
   • De başına 293T/MDCK hücreleri (10-12 Haziran iyi kuyuları) 250 ul ekleyin.
5. 20-30 dakika RT inkübasyon (adım 1.3) sonra, DMEM% 10 FBS% 1 PS 1 ml OptiMEM-LPF2000-influenza DNA plazmid karışımı ekleyin.
6. 250 ul 293T/MDCK hücrelerinin (adım 1.4) ile kuyuların içine 1.3 ml (1.5 adım) ekleyin.
7. 37 ° 6-iyi-plate yavaşça sallamak ve inkübatör (ON) gecede transfeksiyon inkübe izin ° C ve% 5 CO _2.
8. Ertesi gün, yaklaşık 16-24 saat sonrası transfeksiyon, transfeksiyon medya ve 48 saat için 1 mcg / ml TPCK-tripsin içeren PS DMEM% 0.3 BA% 1 transfekte hücreler kuluçkaya yatmaktadır.
9. Değişen medya 48 saat sonra, bir mikrosantrifüj tüp içine transfekte hücrelerden süpernatantı aktarın.
10. 1-2 dakika, 13.000 rpm mikrosantrifüj doku kültürü süpernatant Santrifüj.
11. 6-kuyu levhalar (bir gün önce kaplama) veya 10 günlük civciv adım 1.10 'dan santrifüj doku kültürü süpernatantlar 200 ul embriyolu yumurta taze MDCK hücreleri enfekte. 2-3 gün boyunca 37 ° hücreleri ve / veya yumurta ° C'de inkübe edin.
    1. Enfeksiyon: 10 günlük civciv embriyolu yumurta tavuk embriyolu yumurta bulaştırmak için tüm işlemler, steril koşullar altında yapılmaktadır.
       1. Hava kesesi arasındaki arayüz ve allantoik boşluğuna görmek için bir ışık candling kutusunu kullanarak 10 günlük yumurta Mum. Arayüz sınırında bir kalem işareti olun.
       2. 5 ml şırınga iğne ile bir delik kabuğu olun.
       3. 1 ml şırınga ile, her adım 1.10 'dan doku kültürü süpernatantlar 200 ul yumurta bozar.
       4. Bir pamuklu çubukla kullanarak erimiş balmumu ile kabuğu delik kapağı.
       5. 2-3 gün, 37οC enfekte yumurta inkübe edin.
    2. Enfeksiyon: taze MDCK hücreleri geçit önceki gün öncesi, ortak kültürlerin 293T/MDCK doku kültürü süpernatantMDCK hücreleri ile pare 6-plaka yemekleri ertesi gün% 80-90 izdiham ulaşmak için. Genellikle, bir konfluent 100 mm doku kültürü plakası 6-8 kuyu ayrılabilir. Hücreleri yıkayın, iki kez PBS 1X trypsinize ve 6-iyi plakaları hazırlamak. Hücrelerin üniformalı bir dağılıma sahip olduğu için, yavaşça elle plakalar sallayın. Kültür hücreler, ON, 37 ° C inkübatör,% 5 CO _2. Enfeksiyon önce, bir tek tabaka onaylamak için hücrelerin mikroskop altında kontrol edin; ardından, enfeksiyon ile devam edin:
       • 1 ml PBS 1X, iki kez, hücre yıkayın.
       • Oda sıcaklığında 1 saat süreyle santrifüje doku kültürü süpernatantlar 200 ul bulaştırabilir. Hücreler kuru izin vermeyin. 6-iyi-plate her 10 dakikada Rock.
       • 1 saat sonra viral emilmesi, MDCK hücreleri enfeksiyon medyayı çıkartın ve DMEM 0.3% BA% 1, 1 mcg / ml TPCK-tripsin içeren PS 2 ml ekleyin.
       • 48-72 saat geçtikten sonra, sitopatik etki (CPE) MDCK enfekte olmuş hücreleri gözlenen transfeksiyon verimlilik ve virüs yükü bağlı. CPE başarılı bir kurtarma göstermektedir. Ancak, bir HA assay (2. bölüm) hala doku kültürü Süpernatantları virüsün varlığını tespit etmek için yapılan olmalıdır.
12. Hasat allantoik sıvı enfekte tavuk embriyolu yumurta: allantoik sıvı enfekte yumurta hasat Tüm işlemler steril koşullar altında yapılmaktadır. Allantoik sıvı yaklaşık 8-12 ml, her 10 günlük eski enfekte yumurta hasat edilebilir. Allantoik sıvı hasat önce az 2 saat, 4 tavuk yumurtası (veya ON) inkübe ° C tavuk embriyo öldürmek ve kan pıhtılaşmasını.
    • Steril koşullar kurmak için% 70 etanol ile yumurta kabuklarını yıkayın.
    • Bir kaşık ile dokunarak hava boşluğuna üzerine, dikkatlice, yumurta açın. Forseps yardımı ile kırık kabuğu çıkarın.
    • 1 ml iğne ile yumurta sarısı kırılma olmadan allantoik membranından çıkarın.
    • Allantoik sıvı içine 10 ml lik bir pipet rehber olarak bir spatula ile tavuk embriyo sabitleyin. Yumurta sarısı, herhangi bir kırılma ya da toplama olmayan bir buz kovası buz 15 ml santrifüj tüpü içine mümkün olduğu kadar çok allantoik sıvı olarak toplayın. Her yumurta için 15 ml santrifüj tüpüne kullanın.
    • 4 5 dakika santrifüj ° C ve 15 ml taze bir santrifüj tüplerine allantoik sıvı (pelet kırmızı kan hücreleri almadan) aktarın.
    • 4 santrifüje allantoik sıvı içeren tüpler Mağaza ° C kadar onlar kurtarıldı virüsün varlığı için bir hemaglütinasyon (HA) testi ile kontrol edilir.

2. HA tahlil rekombinant influenza virüslerinin kurtarma onaylamak için

Hemaglütinasyon deneyi (HA), rutin doku kültürü süpernatantlar MDCK ve / veya hasat yumurta allantoik sıvı kurtarıldı virüsün varlığını tespit etmek için kullanılır. Alternatif olarak, immünofloresan testleri (IFA) de yapılabilir. Bir test kurtarıldı virüsün varlığını tanımlayan sonra, virüs, plak saflaştırılmış ve virüsün genetik kompozisyonu, RT-PCR ve sıralama ile teyit edilecek olmalıdır.

Makroskopik tavuk HA (ya da başka bir kaynaktan), kırmızı kan hücreleri (RBC) kullanarak MDCK doku kültürü süpernatantlar ve / veya enfekte yumurta allantoik sıvı virüsün varlığı tespit edilebilir. Virüs yokluğunda kuyunun altındaki kırmızı bir pelet (Şekil 4) oluşumunu sağlar virüsün varlığı, eritrosit hemaglütinasyon neden olur. İnfluenza virüsünün durumda, yaklaşık 10 ³ -10 ⁴ plak oluşturan birim (PFU) HA testi pozitif bir sinyal vermek için gerekli olduğu düşünülüyor; bu nedenle, onaylamak için bir IFA HA testi ile paralel olarak yapılabilir. gerçek negatif sonuç. Daha az 103-104 virüsler Bu tekniği ile tespit edilebilir, çünkü birincil anti-influenza antikorları IFA HA testinin daha duyarlı. , IFA pozitif HA-negatif süpernatantlar veya allantoik sıvıları daha mümkündür. Bu durumda, virüs MDCK hücreleri veya yumurta, tekrar Pasajlanması tarafından amplifiye edilmelidir. Alantoyik sıvı ve / veya ikinci pasaj doku kültürü süpernatantlar artık açıkça HA testi pozitif olmalıdır.

96-V-alt kuyucuğu HA testleri yapılmaktadır. Negatif (örneğin, PBS 1X) ve pozitif (doku kültürü süpernatantlar ve / veya bir grip virüsü enfeksiyonu allantoik sıvı) kontrol örnekleri her zaman bunu doğrulamak için herhangi bir HA tayininde dahil edilmelidir.

• 1X PBS ul 50 V-bottom her iyi 96 plaka içine koyun.
• 50 ul ekleMDCK ilk sıra enfekte yumurta ve doku kültürü süpernatantlar ve / veya allantoik sıvı aşağıdaki kuyuları için 2 kat seri dilüsyonları olun. Son kuyudan ekstra 50 ul atın.
• % 0.5 'her bir kuyunun% -1.0 tavuk, kırmızı kan hücreleri (1X PBS içinde hazırlanan) 50 ul ekleyin.
• V-alt 96-iyi plaka (kırmızı bir nokta, bir negatif kontrol PBS örnek altında görünür oluncaya kadar) 30-45 dakika buz üzerinde inkübe edin. Şekil 4'te gösterildiği gibi sonuçları okuyun ve interpretate.

3. Doku kültürü süpernatantlar geçmesi

HA testi negatif bir sonuç, doku kültürü süpernatantlar ve / veya allantoik sıvı virüs mevcut düşük seviyelerde düşük transfeksiyon verimlilik bir sonucu olabilir. Bu örneklerin, taze MDCK ve / veya embriyolu yumurta Passage Enfeksiyonlar, daha önce bölümünde 1.11.2 açıklandığı gibi yapılır (Şekil 3'te gösterildiği gibi) virüs amplifikasyon sağlayacaktır.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Başarılı grip virüsü kurtarma olumlu bir HA assay (Şekil 4) varlığı ile teyit edilecektir. Ayrıca, doku kültürü süpernatantlar ya da yumurtadan allantoik sıvı ile enfekte hücrelerde CPE varlığı olumlu bir viral kurtarma önerecektir.

Şekil 1. İnfluenza Virüs yapısı: Grip virüsü iki viral glikoproteinler (HA, NA) ve çift katlı lipid içeren bir çevrilidir ayrıca, iyon kanalı protein, M2. HA, viral eki protein, sialik bağlanarak asit içeren reseptörleri sorumludur. NA, ev sahibi hücrelerin viral serbest bırakılması için sorumludur. Çift katlı lipid altında, virion montaj ve tomurcuklanma ve viral ribonucleocapsids nükleer ihracat için gerekli nükleer ihracat proteini (NEP), önemli bir rol oynar iç yüzeyi zarf matriks protein 1, M1, oluşan bir protein tabakası. Çekirdek virüs, viral nükleoprotein, NP encapsidated 8 tek iplikli negatif RNA viral genler oluşan bir ribonükleoprotein (RNP) kompleks yapılır. RNP kompleksi ile ilişkili viral RNA bağımlı RNA polimeraz altbirimden PA, PB1 ve PB2. Tarafından kodlanan RNA segmentlerinde sırasıyla NS ve PB1, yapısal olmayan proteinleri NS1 ve PB1-F2, virion yapısının bir parçası değildir.

Şekil 2. İnfluenza virüs kurtarma plazmid: ambisense plazmid pDZ klonlanmış sekiz influenza virüsünün genleri gösterilir. plazmid pCAGGs ⁷ protein ekspresyonu türetilen plazmid pDZ ^6, bir insan RNA polimeraz I organizatörü ve negatif anlamda genomik RNA kodlayan bir fare terminatör dizisi ile iki yönlü bir plazmid vektörü, ters yönde birleştirmek polimeraz, polimeraz II. transkripsiyon kaset (tavuk β-aktin organizatörü ve Polya) aynı viral gen viral proteinleri kodlar. Her viral segmentinden cDNAs SAPI kısıtlama endonükleaz site ve her segmentin (viral genlerin sonunda kara kutu) noncoding bölgeleri içeren ileri ve geri primerler ile RT-PCR ile üretilir. PCR ürünü Sap-I ile sindirilir pDZ klonlanmış.

Şekil 3. Sekiz plazmid tabanlı influenza kurtarma sistemi: 8 influenza virüs genleri içeren pDZ plazmid ko-kültür (1. gün) 293T-MDCK hücreleri, süspansiyon, co-transfekte vardır. Yirmi dört saat FBS olmadan post-transfeksiyon, medya ama TPCK / tripsin içeren (2 gün) değiştirilmiştir. Kırk sekiz saat medya değiştirdikten sonra, doku kültürü süpernatant hasat ve MDCK veya 10 günlük embriyolu tavuk yumurtası (4 gün) bulaştırmak için kullanılır. 48-72 saat sonrası amplifikasyon, yumurtadan MDCK enfekte hücreleri veya allantoik sıvı doku kültürü süpernatantlar HA (Günde 6) hasat ve virüsün varlığı için test edilir. Herhangi bir virüs tespit edilirse, aynı süpernatantlar ve / veya allantoik sıvıları taze MDCK hücreleri ve / veya embriyolu yumurta içine yeniden geçişli olabilir.

Şekil 4. Hemaglutinin assay (HA): virüs parçacığın eritrosit Hemaglutinasyon makroskopik olarak görünür ve doku kültürü süpernatantlar ve / veya allantoik sıvıları viral parçacıkların algılamak için temelidir. HA testi, viral enfeksiyon olan parçacıklar ve bozulmuş ve hücreleri enfekte etmek artık mümkün parçacıklar arasında ayrım olmamasına rağmen, tahlil örneklerinde virüsün varlığının iyi bir gösterge. A) (alt) biyolojik örnekler virüs varlığı yokluğu (üst) alt plaka ya da onların yokluğunda veya eritrosit varlığı ile belirlenir.ectively. B) saptanabilir virüs seviyeleri (üst) ya da virüs varlığı (altta) ile HA testte bir temsilci sonucu gösterilmiştir.

Discussion

Plazmid DNA rekombinant influenza virüslerinin Kurtarma sonra protokol rutin laboratuarda gerçekleştirilen basit ve kolay bir süreç, ama başında, birden fazla şeyler ters gidebilir. Virüs oluşturmak için iyi bir plazmid hazırlanması zorunludur. (293T ve MDCK) hücre hatları doğru bakım başarılı bir viral kurtarılması için çok önemlidir. Geleneksel olarak, genetik bir etiket sessiz mutagenez, bir grip plazmid gen kodlama içine eklenir. Bu sessiz mutasyon (lar) ve örneğin, yaratılış giriş, bir roman restriksiyon enzimi sitesi enzim sindirimi ile yabani tip ve rekombinant influenza virüsü ayırt etmek için kullanılır. Bu nedenle, rekombinant virüs saflaştırılmış plak amplifikasyon sonra RT-PCR ve sıralama yaklaşımlar kurtarıldı virüs doğa doğrulamak için yapılan olmalıdır. Bu ters genetik teknikler ve plazmid rekombinant influenza virüsleri başarılı kurtarma geliştirme virüsün biyolojisi hakkında belirli sorulara yanıt sağlayacaktır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995-065	Store at 4°C
OptiMEM	Invitrogen	51985-034	Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019	Store at 4°C
TPCK-trypsin	Sigma-Aldrich	T-8802	Store at -20°C
Bovine Albumin (BA)	Sigma-Aldrich	A7979	Store at 4°C
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054	Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X	Invitrogen	15140-122	Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates	Nalge Nunc international	249570
Embryonated chicken eggs Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures. Chicken red blood cells (RBC) Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC). Tissue culture supernatants and allantoic fluids Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C. Plasmids All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2. Viruses The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.