Summary
我们描述了一个反复可视化小鼠小胶质细胞和单核细胞循环的方法
Abstract
神经科学的传统， 在体内小鼠中枢神经系统的两个光子成像，无论是涉及使用开放性颅骨 1,2或变薄， 颅骨 3准备工作。虽然开颅骨技术是非常灵活，它是研究小胶质细胞最优的，因为它是侵入性，并可能导致小胶质细胞激活。即使颅骨变薄，方法是微创，反复慢性成像所需的头骨重新变薄，增加组织损伤和小胶质细胞激活的风险，并允许数量有限的成像会议。在这里，我们提出一个用于监测小鼠小胶质细胞在体内长时间使用双光子显微镜的时间的慢性颅骨薄窗口的方法。我们演示了如何准备一个稳定，方便，皮质变薄，颅骨窗口（TSCW）apposed仍然超过三个星期的间歇性观察过程中的半透明的玻璃盖玻片。这TSCW准备是远远方面比开放开颅手术或反复颅骨变薄的小胶质细胞激活免疫惰性，并允许在一个星期的时间内任意数量的成像会议。我们准备在CX 3 CR 1 GFP / +小鼠4 TSCW可视化与增强型绿色荧光蛋白≤150下方的软脑膜表面微米的小胶质细胞。我们还表明，该制剂可与HIV - 1蛋白的神经毒性达，毗邻TSCW，这是能够诱导持久microgliosis的立体定向脑注射液配合使用。因此，这种方法是非常有用的研究生活在艾滋病毒有关的神经认知障碍（手）和其他神经退行性疾病与neuroinflammatory组件模型的脑小胶质细胞形态和活力随着时间的推移变化的。
Protocol
1。准备成像动物
- 在我们的实验中，我们使用成人CX 3 CR 1 GFP / +小鼠单核细胞谱系，包括小胶质细胞表达绿色荧光蛋白在4株小鼠不同，可用于满足特定项目的需要。
- 0.05毫克/公斤芬太尼，5.0毫克/公斤咪达唑仑和0.5毫克/公斤Medetomidine组成了三个药物鸡尾酒腹腔注射麻醉鼠标5 TSCW手术准备后开始的动物不再以疼痛刺激的反应，例如作为一个尾巴掐。整个手术和成像，我们一直在加热垫的动物，以防止麻醉后体温过低。如果有必要，原剂量的麻醉剂鸡尾酒助推器剂量的三分之一，可以考虑恢复原有的麻醉平面。
- 盖与保护眼药膏的动物的眼睛保持在麻醉过程中的眼睛湿润了，这会抑制动物的眨眼反射。取下的头发从头皮的动物，用一把剃刀，剪刀，剪刀，或化学的方法。使用10％的碘伏溶液和70％的乙醇消毒头皮。所有手术器械需要进行高压灭菌，用玻璃珠的灭菌，或用70％乙醇消毒灭菌。
- 制作的头皮，用小剪刀正中切口，开始4-5毫米，尾鳍的头骨和推进着眼睛的前面。重要的是，此切口足够长，皮肤不会干涉的双光子成像（图1），用于在稳定的小鼠的头部，头部板胶合。确定要根据解剖范围变薄的区域。避免直接位于颅缝线以上，头骨是不太稳定，在这些领域和潜在的大血管和脑膜会干扰成像感兴趣的领域。
- 应用100％的乙醇，用无菌棉签干燥头骨顶部的膜，并用细镊子或刀片刮去他们走了10％三氯化铁溶液。未能消除不稳定的头板附着在膜的结果。
- PERMABOND 910胶头板下方的观景窗的边缘周围放置一个薄薄的一层。将头板用胶水涂在动物的头骨压光（图1）利息的面积。重要的是，头盘是只粘在颅骨骨。任何皮肤或陷入头板与颅骨之间的膜，将降低债券的稳定。周围观看的窗口使用一个注射器瞬间粘合胶，适用于少量的丙烯酸酯。最后，申请一个观景窗的边缘少量乐泰454，以防止泄漏。
- 螺丝头盘动物的持有人（图1），并检查头板下一双镊子轻轻探清扫范围的稳定。不应该有骷髅头板相对运动。广场上的观景窗，以确保没有泄漏的生理盐水下降。
2。准备减薄的头骨皮层窗口
- 在准备颅骨变薄，干燥颅骨结合使用无菌棉签和压缩空气。最初，我们在Microtorque二钻无菌IRF 007钻在4000转位颅骨薄。轻轻地，开始变薄一个2-2.5毫米直径的圆形区域内的头骨。使用唯一的光线扫近于平行的头骨的议案;使用没有直接的下调压力。停钻，每20-30秒，去除骨灰尘，使用压缩空气。在钻井这些中断允许头骨凉爽，所以没有热诱导的基本脑组织的损害。
- 由于钻井过程中，发现湿润的骨松质层（即“板障”）的过渡。一旦达到这一层与演练，锻炼时要格外小心。
- 偶尔检查放在盐水在薄区和观看下解剖范围内的头骨薄。萨林将进一步使散热。由于颅骨变薄，较小的血管变得可见。
- 使用无菌牙科microblade实现下生理盐水的最后变薄，microblade提供触觉反馈的头骨稳定得多。这可以比单钻薄得多的筹备工作。从我们的经验，最佳的颅骨厚度为10-30微米。
- 重要的是要检查epifluorescence多次下颅骨的薄，在最初的几次尝试使颅骨薄窗口。窗口时，成像的清晰度和可见的小胶质细胞和血管的深度给一个很好的迹象。
- 一旦窗口已准备就绪，胶水定做一块长方形玻璃罩无线0＃第一个窗口每边尺寸小于2毫米以上。使用一个直径为1.0毫米的玻璃吸管，地方上薄的头骨面积氰基丙烯酸酯胶的小水滴和仔细下来的小块盖玻片，然后按对头骨轻轻挤压出过量的胶水。重要的是要避免泡沫形成之间的玻璃和胶水，因为残留的空气会导致该地区的下方，成为光学不透明。氰基丙烯酸酯胶使用，因为它保持透明，干燥时，还可以防止骨和膜的再生，维持颅骨薄，半透明的窗口下。如果有任何胶玻璃盖的顶部，使用microblade小心取出玻璃盖一次到位和胶水干。
- 止痛药（例如，丁丙诺啡2毫克/公斤分cutaneously）管理后立即手术，重管理，在任何疼痛的迹象，包括不愿动，吃或喝，消瘦，流涎，立毛，呼吸音，等
3。双光子成像
- 在准备双光子成像，盖用生理盐水TSCW和定位下epifluorescence利益的区域（图2）。为了使该地区的后续成像，使用照相机拍照。
- 双光子成像，我们用一个特制的双光子显微镜与TI 6：蓝宝石激光调谐到920纳米。整个现场检测模式和一百八十零分之五百八十〇排放过滤器中使用光电倍增管检测荧光。 20倍水浸泡镜片（0.95 NA）的使用在整个成像会议。客观的激光功率的最大输出功率为50和65兆瓦之间。
- 选择感兴趣的领域，在皮质层I或II（高达150微米以下的软脑膜表面）。为了便于重新成像，采取相同的视野图片1X，2X，3X数码变焦。血管可作为地标，很容易地找到在随后的成像会话相同的视野。根据80-90变焦的3倍，多的Z -栈在每个堆栈和一个0.69微米的一步的Z轴的步骤可以收购每5分钟至30分钟，这使小胶质细胞的形态和行为随着时间的推移，抽样（图3）。 Z -栈之间的收购，应核实在TSCW生理盐水水平，以及动物的麻醉深度。
4。注射HIV - 1的神经毒素，达
- 首先，silanize内衬的35号针和10μL微量注射器，防止达沉积。撤回的silanizing解决方案（Sigmacote），直到填满的针头和注射器。允许的解决方案，坐在在室温下5分钟。空注射器的解决方案，取出柱塞，并允许完全干燥的注射器和针头。最后，清洗彻底，用去离子水的注射器和针头。
- 执行一个小开颅0.5毫米直径无论是3毫米延髓或横向的双光子图像已取得TSCW，使用较小的钻头，并仔细颅骨变薄，直到一双尖的镊子，可以去除薄层骨容易。我们用10μL微量注射器，装有35压力表控制针Ultramicropump三注射器泵安装一个3轴的显微和排队针尖开颅后，仔细先进的深度为700至900微米以下3μL达1-72（或其他亲消炎药）或生理盐水（或控制车辆），是在80 NL /分钟的软脑膜表面。
5。畜舍
- 如果动物是要在一天多次成像，盖用眼药膏和凡士林，以防止身体不适或损坏的头骨在会话之间的成像混合物的头骨的开放区域。断开小头板（见图1B）支持的桥梁，方便食品和水，并放置在一个温暖的笼子动物。所有动物都被安置在任何时候接受手术后单。一旦某一天的完整的动物成像会议，小心地取出整个头板和背部的皮肤在颅骨缝合＃6或更小的缝合。同样，单独房子的动物实验天之间的方便食品和水。每天检查的动物，任何压力的迹象，疼痛或感染。
6。代表性的成果
图1手术和双光子成像（A）和头板设计（二）动物的稳定。
图2 GFP标记的小胶质细胞的可视化与epifluorescence。
图3。 GFP标记的小胶质细胞与双光子成像的可视化后植入TSCW，约50微米以下的软脑膜表面。单一双光子TSCW（0天）植入后15-30分钟的部分，以及7 17天后，展示的Windows保持清晰，而小胶质细胞在没有炎症侮辱的情况下仍然灭活。 Z - 6和预测，采取24小时后注射艾滋病毒的神经毒素达表现出令人印象深刻的激活小胶质细胞的形态学变化。比例尺：10微米。
Discussion
有越来越多的共识，为HIV - 1相关的神经认知赤字（手）的实际基板是突触结构的破坏，大概是从HIV - 1感染单核吞噬细胞释放炎症介质，引起。的小胶质细胞激活，多核巨细胞，胶质细胞增生由于星形胶质细胞肥大，被认为是在中枢神经系统7 HIV - 1感染和炎症的非特异性标志。相比之下，生前神经系统疾病的严重程度已与损失突触的复杂性，以及在中枢神经系统的巨噬细胞8,9,10,11负担。但是，小胶质细胞，周边浸润的巨噬细胞，患者用手的神经元之间的动态交互根本无法使用传统的静态的处理从传统的免疫细胞化学研究取得建模。从我们的实验室最近的研究表明，至少有一些外周和中枢的单核细胞和神经元之间的这些交互可以模拟立体定向注射的HIV - 1蛋白达1-72部分脑实质（路，标记，特朗布莱益气，和格尔巴德，未发表数据）。因此，我们决定申请在体内的双光子成像检查单核细胞衍生的巨噬细胞，脑居民小胶质细胞和神经元之间的相互作用，neuroAIDS一个听话的小动物模型。虽然开放的颅骨或变薄，颅骨准备买得起一个一个时间短暂的时期（小时）皮质架构单一的检查，调查的亚急性事件的时间当然可以不使用不artifactually激活小胶质细胞/巨噬细胞因手术操纵的这些准备工作感兴趣颅骨窗口。在这里，我们展示了一个简单的方法绕过这些限制胶合薄的头骨面积小片，防止再生的颅骨在TSCW以及为≥3个星期保持半透明的玻璃盖玻片。我们进一步证明了这种技术，使我们能够监测在应对艾滋病毒达 1-72立体注射皮质CX 3 CR 1 / GFP的杂合子小鼠外周血单核细胞进入大脑微血管，以及大脑居民的小胶质细胞的行为（确定的单核血统细胞）。这种技术可以很容易地适应使用上具有不同的遗传背景的小鼠，例如，我们经常使用杂合子CX 3 CR 1 / GFP的X THY - 1 YFP的 12只小鼠，以探讨单核细胞衍生的巨噬细胞，脑驻地小胶质细胞和神经元之间的相互作用在体内模型的neuroinflammation有关手。我们TSCW准备允许调查研究之间的周边和中枢神经系统，可能发生在周期间，其中的动物，可反复实验性治疗前后成像的细胞间的相互作用。因此，每个动物可以作为自己的控制。这个TSCW模型的一个需要注意的是，受调查的靶细胞是基因工程表达增强荧光蛋白（eXFP），或与荧光染料没有违反颅骨的机械标记; eXFP表达必须强大到足以使细胞结构可视化后，通过一个星期内重复成像会议。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢刘慧卿凯利头板设计。
我们感谢美国国立卫生研究院奖励支持HAG：RO1 MH56838 MH64570，PO1，RO1 MH078989，R21 MH03851，没有这项工作不可能有贺Waasdorp小儿神经基金的慷慨支持。 AKM的是由美国国立卫生研究院（EY019277），白厅基金，Alfred P. Sloan基金会和在生物医学科学研究所从宝来惠康基金事业奖。 MET是由一个全宗RECHERCHE EN SANTE魁北克（FRSQ）博士后奖。东风是一个在医学科学家培训项目由美国国立卫生研究院的T32 GM07356和T32 AI049815资助，学员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | Hospira Inc. | ||
| Midazolam hydrochloride | Baxter Internationl Inc. | ||
| Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | |
| Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | ||
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | ||
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | |
| Cyanoacrylate | The Original Superglue | ||
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| 10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments, Inc. | ILS010LT | |
| UltraMicroPump III | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| 35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments, Inc. | NL35BL-2 | |
| Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments, Inc. | 501860 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
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