Summary
우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을 설명
Abstract
전통적으로 신경 과학에서 생체내에 murine 중추 신경계의 두 광자 영상도 오픈 두개골 1,2 또는 thinned - 두개골 3 준비의 사용을 참여했다. 오픈 두개골 기술은 다용도로 쓰인다하는 동안 그것이 침략하고 microglial 활성화를 일으킬 수 있기 때문에, 그것은 microglia 공부를위한 최적되지 않습니다. thinned - 두개골 접근 법으로서에도 불구하고, 만성 이미징에 필요한 두개골 다시 밝은 반복하면 조직 손상과 microglial 활성화의 위험을 증가 및 이미징 세션의 제한된 수의를 허용합니다. 여기서 우리는 두 광자 현미경을 사용하여 오랜 시간 동안 생체내에 murine microglia을 감시하는 만성 박막 해골 창 방법을 제시한다. 우리는 간헐적인 관찰의 세 주 과정을 통해 투명 남아 apposed 유리 coverslip와 안정, 접근, thinned - 두개골 대뇌 피질의 창 (TSCW)를 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 TSCW 준비가 훨씬 더 immunologically 불활성 숱이 오픈 craniotomy 또는 반복 두개골보다 microglial 활성화와 관련되고 주 기간 동안 이미징 세션의 임의의 숫자 수 있습니다. 우리는 pial 표면 아래 ≤ 150 μm의 향상된 녹색 형광 단백질과 microglia을 시각화하는 CX 3 CR 1 GFP / + 생쥐 4 TSCW을 준비합니다. 우리는 또한 이러한 준비가 내구성이 microgliosis을 유도하는 능력이 TSCW에 인접 태트 HIV - 1 neurotoxic 단백질의 stereotactic 뇌 주사와 함께 사용할 수 보여줍니다. 따라서,이 방법은 HIV 관련 Neurocognitive 장애 (수동)과 neuroinflammatory 구성 요소와 다른 neurodegenerative 질병 모델로 살아있는 두뇌에 시간이 지남에 따라 microglial 형태학 및 운동성 변화를 조사를 위해 매우 유용합니다.
Protocol
1. 이미징을위한 동물 준비
- 우리의 실험에서, 우리는 microglia 포함한 mononuclear 세포 lineages에 표현 GFP. 생쥐의 4 가지 변종이 특정 프로젝트의 요구를 충족하는 데 사용할 수있는 성인 CX 3 CR 1 GFP / + 마우스를 사용합니다.
- 동물이 더 이상 통증 자극에 반응하지 후 0.05 밀리그램 / kg 펜타 닐, 5.0 MG / kg Midazolam 및 0.5 밀리그램 / kg Medetomidine 구성된 세 마약 칵테일의 intraperitoneal 주사와 마우스를 마취. TSCW 5 외과 준비, 시작 등 꼬리 핀치로. 수술과 영상 전반에 걸쳐, 우리는 포스트 마취의 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드에있는 동물을 유지. 필요한 경우 1, 3 분의 1의 부스터 선량은 마취 칵테일의 원래 복용량은 원래 마취 비행기를 복원 부여하실 수 있습니다.
- 마취 동안 눈을 촉촉한 유지 보호 안과 연고와 동물의 눈을 감아라, 이것은 동물의 깜빡 반사를 표시하지 않습니다. 면도칼을 사용하여 동물의 두피에서 머리카락, 가위, 가위, 또는 화학적 방법을 제거합니다. 10 % povidone - 요오드 용액과 70 % 에탄올을 사용하여 두피를 소독. 모든 수술 장비 유리 비드 살균기, 또는 70 % 에탄올로 소독과 멸균, autoclaved해야합니다.
- 두개골에 꼬리 4~5밀리미터를 시작하고 눈 앞에 앞으로 발전, 작은 가위를 사용하여 두피의 정중선 절개를합니다. 이 절개가 충분히 피부가 두 광자 이미징 (그림 1) 동안 마우스 머리를 고정하는 데 사용되는 머리 판의 gluing 방해하지 않을 것이 중요합니다. 해부 현미경 thinned으로 지역을 식별합니다. 두개골이 분야에서 덜 안정 및 대형 선박과 meninges을 기본 것은 이미지에 영향을하므로 직접 두개골 봉합 이상있는 관심의 영역을 피하십시오.
- 두개골의 상단에있는 세포막을 건조하고 고급 핀셋 또는 면도날을 사용하여 거리를 긁어 멸균 면봉과 산화철 염화의 10 % 용액 다음 100 % 에탄올을 적용합니다. 불안 정한 헤드 플레이트 첨부의 세포막 결과를 제거하는 실패.
- 머리 접시 아래에있는보기 창의 가장자리 주변 Permabond 910 접착제의 얇은 레이어를 놓습니다. 빛의 압력 (그림 1)와 동물의 두개골에 대한 관심의 영역 접착제로 코팅 머리 접시를 놓습니다. 머리 판에만 두개골의 뼈에 붙어있다 것이 중요합니다. 머리 판과 두개골 사이에 잡힐되는 피부 또는 점막은 채권의 안정성을 감소합니다. 즉시에 주사기 본드 접착제를 사용하여보기 창의 주위 아크릴 레이트의 작은 금액을 적용합니다. 마지막으로, 누출을 방지하기 위해 시청 윈도우의 가장자리에 Loctite 454의 작은 금액을 적용합니다.
- 동물 홀더 (그림 1) 머리 플레이트 비할 가볍게 포셉 한 쌍의로 탐색하여 절개 범위에서 머리 판의 안정성을 확인합니다. 머리 접시에 상대적으로 두개골에 대한 움직임이 없어야합니다. 아무 누수가 없다 않도록 보는 창에서 호수의 드롭 놓습니다.
2. Thinned 해골 두피 창 준비
- 두개골을 벗겨 준비에서 무균 목화 면봉 및 압축 공기의 조합을 사용하여 두개골을 건조. 4000 RPM으로 설정 Microtorque II 훈련에 살균 IRF 007 드릴 비트와 함께 두개골을 우리는 처음에 얇은. 아주 부드럽게, 두개골의 2-2.5 mm 직경 원형 지역을 고르고 시작합니다. 두개골에 거의 평행 광만을 청소 동작을 사용하며, 직접적인 하향 압력을 사용하지 않습니다. 압축 공기를 사용하여 뼈 먼지를 제거하는 모든 20~30초을 드릴링 중지합니다. 드릴링에서 이러한 휴식은 기본 뇌 조직에 더 열을 유발 손상이 없습니다 때문에 두개골 괜찮아 수 있습니다.
- 시추가 진행되면서 moister 해면 뼈 계층 (예 : "diploe")로의 전환을 확인합니다. 이 레이어에 도달되면, 드릴 여분주의.
- 때때로 thinned 영역 살린 배치 및 해부 현미경으로 보면 두개골의 두께를 확인하십시오. 호수가 추가로 방열을 사용합니다. 두개골이 thinned이므로, 작은 vasculature가 표시됩니다.
- microblade은 두개골의 안정성에 대한 더 많은 촉각 피드백을 제공하는 등 생리에 따라 숱이 최종 달성하기 위해 살균 치과 microblade을 사용합니다. 이것은 혼자 드릴보다 훨씬 얇은 준비를 위해 수 있습니다. 우리의 경험에서 최적의 두개골 두께는 10-30 μm의 수 있습니다.
- 얇은 두개골 윈도우를 만들기에있는 처음 몇 시도하는 동안 epifluorescence 여러 번 아래에있는 두개골의 두께를 확인하는 것이 중요합니다. 보이는 microglia과 vasculature의 선명도와 깊이 창 이미지 준비 때만큼 잘 알려주지.
- 일단 창이 접착제는 # 0 coverglass WI의 사용자 정의 - 만든 사각형 조각, 준비 창문이 지남에 따라 각 면에 미만 2mm의 크기 일. 1.0 mm 직경의 유리 피펫을 사용하여 thinned 두개골 지역에 cyanoacrylate 접착제의 작은 방울을 배치하고 coverslip의 작은 조각 아래 신중하게 낮은, 다음 접착제를 초과하는 금액을 짜내다로 두개골에 대해 부드럽게 누르십시오. 광학 불투명 될 수 밑에 갇힌 공기가 지역의 원인이 있기 때문에 이것은 유리와 접착제 사이의 거품 형성을 방지하는 것이 중요합니다. 그 때 건조 투명 남아 있으며, 뼈 및 얇고 반투명 창 아래에있는 두개골을 유지 막 regrowth을 방지하기 때문에 cyanoacrylate 접착제가 사용됩니다. 커버 유리 상단에있는 접착제가있다면, 커버 유리가 자리하고 접착제가 건조되면 신중하게 그것을 제거하는 microblade을 사용합니다.
- 진통제 (예를 들어, Buprenorphine 2 MG / 서브 cutaneously kg)은, 체중 감소, 타액의 분비, piloerection, 호흡 소리, 이동 먹지도 않고 마시지도 않으려는 등 수술 후 즉시 시행과 고통의 흔적에 다시 관리합니다 등등
3. 두 광자 이미징
- 두 광자 이미징을위한 준비에 호수와 TSCW을 차지하고 있으며 epifluorescence에 따라 관심 영역 (그림 2)를 찾습니다. 지역의 이후 이미지를 사용하려면, 사진 카메라를 사용하여 사진을 찍었.
- 사파이어 레이저 920 nm의에 조정된 : 두 광자 이미징을 위해, 우리는 티로 맞춤 제작된 두 개의 광자 현미경 6 사용합니다. 형광은 전체 - 현장 감지 모드와 180분의 580 방사 필터에 photomultiplier 튜브를 사용하여 감지됩니다. 20X 물 침지 렌즈 (NA 0.95) 이미징 세션 전반에 걸쳐 사용됩니다. 목적에 레이저 파워의 최대 출력 50 65 MW 사이에 설정됩니다.
- 대뇌 피질의 레이어에 대한 관심의 영역 I 또는 II (pial 표면 아래에 150 μm의)을 선택하십시오. 다시 영상을 촉진하기 위하여, 1X, 2X 볼 같은 분야의 사진을, 그리고 3 배 디지털 줌. 혈관 쉽게 후속 영상 세션 동안 볼 같은 분야를 찾는 랜드마크 역할을하실 수 있습니다. 80-90로 3 배, 다중 Z - 스택의 확대에 따라 각 스택 및 0.69 μm의 단계에서 Z - 단계 (최대 시간이 지남에 따라 microglial 형태와 행동의 좋은 샘플링을 가능하게 30 분, 위해 5 분마다 취득 수 있습니다 그림 3). Z - 스택의 인수 사이에, 하나는 TSCW를 통해 호수의 수준뿐만 아니라 마취의 동물의 깊이를 확인한다.
4. HIV - 1 Neurotoxin, 태트의 분사
- 첫째, 35 게이지 바늘과 태트 증착을 방지하기 위해 10 μL Microvolume 주사기의 내부 안감을 silanize. 그것은 바늘과 주사기를 모두 채우고 때까지 silanizing 솔루션 (Sigmacote)을 철회. 상온에서 5 분 앉아에 대한 해결책을 허용합니다. 주사기에서 솔루션을 비우기, 플런저를 제거하고 주사기와 바늘이 완전히 건조 수 있습니다. 마지막으로, 탈이온수과 함께 철저하게 주사기와 바늘을 씻으십시오.
- 지름도 작은 드릴 비트를 사용하여 주동이의 또는 두 개의 광자 이미지가 얻은되었습니다 TSCW하는 측면 3mm에 작은 craniotomy 0.5 mm를 수행하고 신중하게 날카로운 팁을 포셉 한 켤레까지 두개골을 고르고 것은의 thinned 레이어를 삭제할 수 있습니다 쉽게 멀리 뼈. 우리는 3 축 micromanipulator과 craniotomy에 바늘 끝을 라이닝 후 장착 Ultramicropump III 주사기 펌프에 의해 제어되는 35 게이지 바늘로 장착되어 10 μL Microvolume의 주사기를 사용하여 그 아래에 900 μm의 700의 깊이에 신중 고급입니다 3 μL 태트 1-72 (또는 다른 프로 염증성 대리인) 또는 생리 (또는 제어 차량) 80 NL / 분 전달 pial 표면.
5. 동물 주택
- 동물은 하루에 여러 번 몇 군데있다면, 안과 연고 및 이미징 세션 사이에 불편함이나 두개골 손상을 방지하기 위해 바셀린의 혼합물로 두개골의 열린 영역을 커버. 작은 헤드 플레이트 (그림 1B 참조)에서 지원 다리를 분리하고 쉽게 접근할 음식과 물을 따뜻하게 새장에 동물을 놓으십시오. 모든 동물은 항상 수술 후 단독으로 위치해 수 있습니다. 동물 이미징 세션은 주어진 하루 완료되면 조심스럽게 머리 판 전체를 제거하고 # 6 또는 작은 봉합과 두개골을 통해 다시 피부를 봉합. 다시 실험 일 사이 쉽게 접근할 음식과 물로 단독 동물 집. 모든 스트레스의 흔적, 고통, 또는 감염 매일 동물을 확인합니다.
6. 대표 결과
그림 1. 수술과 두 광자 영상 (A)와 헤드 플레이트 디자인 (B)에 대한 동물의 안정화.
그림 2. GFP - 라벨 microglia는 epifluorescence와 시각.
그림 3. GFP - 라벨 microglia는 TSCW의 주입 후 두 광자 이미징과 시각, 약 50 pial 표면 아래 μm의. TSCW (일 공)의 주입 후 15-30분 데리고 싱글 두 광자 섹션뿐만 아니라, 7 17일 후, microglia가 염증 모욕의 부재에 inactivated 남아있는 동안 창문을 확실히 유지 것을 보여줍니다. Z - 투영 6 촬영한 24 시간 활성화된 microglia의 에이즈 neurotoxin 문신 전시 인상 morphologic 변경 후 주사. 스케일 바 : 10 μm의.
Discussion
HIV - 1 관련 neurocognitive의 결손 (수동)에 대한 실제 기판은 아마도 HIV - 1 감염 mononuclear phagocytes에서 출시된 프로 염증 중재자에 의한 시냅스 아키텍처의 파괴는 것을 강력히 주장하고있다. Microglial 활성화, multinucleated 거대한 세포, 그리고 astrocytic 비대로 인한 gliosis은 CNS 7 HIV - 1 감염과 염증의 특이 현상이 특징으로 간주됩니다. 반면, premortem neurologic 질환의 심각도는 시냅스 복잡 손실뿐만 아니라 CNS 8,9,10,11에서 대식 세포의 부담과 상관되었습니다. 그러나, microglia, 주변 침투 macrophages, 그리고 손으로 환자의 뉴런 사이의 역동적인 상호 작용은 단순히 기존의 immunocytochemical 연구에서 얻은 종래의 고정 처리를 사용하여 모델 수 없습니다. 우리 연구소의 최근 연구 주변 및 중앙 mononuclear 세포와 뉴런 사이의 이러한 상호 작용의 적어도 일부가 뇌 실질 조직 (류, 마커, 트렘블리로 HIV - 1 단백질 태트 1-72의 stereotactic 주사로 부분 모델 수있는 것을 제안했습니다 치, 그리고 Gelbard, 발표되지 않은 데이터). 따라서 neuroAIDS에 대해 다루기 쉬운 작은 동물 모델에서 단핵구 파생 macrophages, 뇌 주민 microglia과 뉴런 사이의 상호 작용을 검토하는 생체내 두 광자 이미징에 적용하기로 결정했다. 오픈 두개골 또는 thinned - 두개골 준비 시간이 짧은 기간 (시간)에 대한 대뇌 피질의 건축의 단일 심사, artifactually 인해의 수술 조작에 microglia / 대식 세포를 활성화하지 않고 이러한 준비를 사용할 수 없습니다 아급성 이벤트의 시간 코스에 관심이 조사 여유가 있지만 calvarial 창. 여기 gluing TSCW의 재생에서 두개관을 방지뿐만 아니라 ≥ 3 주간 반투명을 유지 thinned 두개골 영역 유리 coverslip의 작은 조각하여 이러한 한계를 우회의 간단한 방법을 보여줍니다. 우리는 더이 기술이 우리 (CX 3 CR 1 / GFP에 대한 heterozygous 생쥐의 피질에있는 HIV 태트 1-72의 stereotactic 분사에 대한 응답으로 뇌성 microvasculature뿐만 아니라 두뇌 주자 microglia를 입력 주변 monocytes의 행동을 관찰 할 수 있습니다는 것을 보여준다 mononuclear 혈통의 세포를 식별). 이 기술은 쉽게 다른 유전 배경을 가진 생쥐를 사용하여 적용할 수 있습니다, 예를 들어, 우리는 정기적으로 heterozygous CX 3 CR 1 / GFP를 사용하여 X 뜻 - 1 단핵구 파생 macrophages, 뇌 주민 microglia 및 뉴런 간의 상호 작용을 조사하기 위해 YFP 12 쥐 손에 관련 neuroinflammation의 생체내 모델 인치 우리 TSCW 준비는 조사관은 주변과 동물 실험 반복 치료 전후에 몇 군데 수있는 주간의 기간, 이상 발생할 수 있습니다 CNS 사이 세포 세포의 상호 작용을 공부하실 수 있습니다. 따라서, 각 동물 자체 제어로 검색할 수 있습니다. 이 TSCW 모델에 대한 하나 주의해야 할 점은 조사에서 대상 세포 중 유전자 향상된 형광 단백질 (eXFP)를 표현하거나 두개 관의 기계적 위반하지 않고 형광 염색이 표시 설계해야 할 것입니다, 그 eXFP 표현은 충분히 강력한해야합니다 셀룰러 아키텍처 주 기간 동안 반복 이미징 세션 이후 시각 될 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 머리 플레이트 디자인 에밀리 A. 켈리 감사합니다.
우리는 노파에게 NIH 보너스의 지원에 대한 감사 : PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851이 작업이 가능 않았을 텐데 어떤 않고 제프리 Waasdorp 소아 신경과의 기금의 관대한 지원합니다. AKM은 NIH (EY019277), 화이트홀 재단, 알프레드 P. 슬로안 재단과 버로우즈 웰컴 기금에서 의생명 과학의 경력 수상으로 후원됩니다. MET는 퐁 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ) 박사 교육 수상에 의해 후원됩니다. DFM은 NIH T32 GM07356 및 T32 AI049815에 의해 재정 지원 의료 과학자 훈련 프로그램에 연수생입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | Hospira Inc. | ||
| Midazolam hydrochloride | Baxter Internationl Inc. | ||
| Medetomidine hydrocholoride (Domitor) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | Ricca Chemical Company | 3120-32 | |
| Methyl cyanoacrylate 910 | Permabond | ||
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate | Co-Oral-lte Dental Mfg CO | ||
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Norland bendable microblade full radius | Salvin Dental | BLAD-NORLAND-69 | |
| Cyanoacrylate | The Original Superglue | ||
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| 10 μl Microvolume syringe | World Precision Instruments, Inc. | ILS010LT | |
| UltraMicroPump III | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | |
| 35 gauge NanoFil needle | World Precision Instruments, Inc. | NL35BL-2 | |
| Ball Mill, Carbide bits #1/4 | World Precision Instruments, Inc. | 501860 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
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