Summary
このビデオと補足資料では、我々は慢性のプロトコルを示す
Abstract
二光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）を用いた in vivoイメージングでは無傷の脳で生きている細胞と神経突起の研究ができます。ここで紹介するテクニックは、中枢神経系におけるシナプス後興奮部位の大部分を表す小さな構造である樹状突起の追跡を可能にする顕微鏡の分解能を持ついくつかの時点（慢性の画像）で脳の同じ領域のイメージングを可能にします。明らかにいくつかの時点では問題なく皮質の構造を解決するためには、シナプスと回路のリモデリングにおける形態学的変化は、根本的なメカニズムを説明することがする脳の可塑性の研究では特に、多くの利点があります。このビデオと補助材料では、我々は、間伐、頭蓋骨の準備を使用して無傷の脳のin vivoイメージング慢性ためのプロトコルを示す。間伐-頭蓋骨の準備は、このように炎症反応の発症を減らすこと、硬膜および/または皮質が損傷する可能性を回避する低侵襲アプローチ、である。このプロトコルが正しく実行されると、それは明らかに長期間にわたって無傷の脳内の樹状突起棘の特性の変化を監視することが可能です。
Protocol
- 二光子顕微鏡、ニューロンが蛍光マーカーで標識されている準備を使用して無傷の脳内の神経細胞を可視化するために使用されます。実験で我々は層5錐体細胞には1をラベルする GFP - Mトランスジェニックマウスのラインを使用するここで紹介。層5錐体細胞は、PIAのレベル以下に300μmの深さに樹状突起と樹状突起棘の可視化を可能に、浅層に樹状突起を投影。代替アプローチは、ウイルスマーカーを用いて細胞を（ らロウェリーを参照してください。、Joveのために提出された）ラベルを付けることです。
- 無菌手術のために70％エタノールおよびオートクレーブのツールを使用してワークスペースを滅菌する。きれいなドレッシングを使用してオペレーティング表面を覆う。
- IACUC承認された手順を使用してAVERTINの四半期投与量（0.0075 mg / ml）を、続いフェンタニルカクテル（metatomadinは0.5 mg / kg体重;ミダゾラム5 mg / kgのフェンタニル0.05 mg / kg体重）をマウスに麻酔。鎮痛剤をマウスに前処理、ブプレノルフィン（0.5 mg / kg）を（SQ）皮下投与。テール/つま先ピンチに反応をテストすることによって、麻酔薬平面のレベルを監視します。
- 37.5で動物を維持° C添付の直腸温度計で加熱毛布を用いた。
- 乾燥から目を防ぐために、眼に眼軟膏を適用します。手術中に、光源から目を保護するために紙の小さなシートとフードの目。
- はさみを使って、目に頭の後ろ（耳の後ろ）から髪を削除する。
- 70％エタノールのシーケンシャルアプリケーションと動物の頭の上をきれいに、betadineスクラブとbetadineの溶液を加えた。
- 眼への正中線（イメージ化される半球に応じて）の右側または左側に沿って耳と、最大の後ろにL -カットの切開を行います。手術部位から皮膚を倍以上との距離。皮膚がイメージングセッションは、次縫合されるため、皮膚を削除しないでください。
- 微細な鉗子を使用すると、静かに関心のある分野から持ち上げ、皮膚を引っ張る。
- 優しく清潔なピンセットや顕微ブレードと頭蓋骨の露出面積から骨膜を削り取る。綿棒を使用して、完全に骨膜メンブレンを乾燥させると、それは完全に削除されていることを保証するために頭蓋骨に10％塩化第二鉄を少量。頭蓋骨は（11を参照）接着剤の適切な付着を確保するために、完全に乾燥していることが重要です。鉗子または顕微ブレードを使用して、静かに乾燥させ骨膜の膜をこすり落とす。
- ステンレス鋼のヘッドプレート（図1を参照）し、印を押さなけれ頭蓋骨にプレートのイメージングのウィンドウ周りシアノアクリレート接着剤の薄層を適用します。
- 綿綿棒の棒の木の端を使用して、画像ウィンドウの内側の縫い目に接着剤を適用し、イメージングプレートと頭蓋骨の曲率の間のすべてのギャップを埋めることを確認すること。
- ウィンドウに接着剤のアクセラレータのドロップを置きます。すぐにワイプ綿棒または金と過剰な接着剤のアクセラレータを拭き取る。接着剤は完全に掘削する前に固化してください。
- 0.7ミリメートルのステンレス鋼ばりを貼付歯科用ドリルを用いた撮像ウィンドウで頭蓋骨を薄くし始める。 0.9％滅菌生理食塩水の臨時のアプリケーションで代替掘削は頭蓋骨上にあまりにも多くの熱を生成しないように。
- 歯科用ドリルで頭蓋骨の表面全体に小さなストロークを使用して頭蓋骨上に薄いの4x4 mmのウィンドウ。平滑末端の鉗子で頭蓋骨の薄さをテストします。頭蓋骨の表面は穏やかな圧力をわずかにインデントされます。イメージングに最適な頭蓋骨の厚さは10〜30μmである。
- 頭蓋骨が薄いと、すべての破片を掃除窓の場合は、頭蓋骨に生理食塩水を置きます。解剖スコープに取り付けられたデジタルカメラとイメージングのウィンドウを撮影。脳血管系の写真と使用は、その後のイメージングセッションのためにイメージングプレートを配置する位置を見つけるのに役立ちます。
- 2光子リグに動物を輸送しています。動物全体のイメージングセッション中に加熱毛布（直腸プローブ付き）にままにしてください。注：鎮静下にある間、動物の体温は、皮質損傷または場合によっては死に至る加熱装置のない状態で大きく変動します。
- マイタイレーザー、最大電力および変更されたオリンパスFluoview共焦点ユニット用10Wソリッドステートポンプを使用した2光子顕微鏡が使用されます。システムは、脳からの蛍光の最大の検出を可能にするために可能な限り客観的に近いとしてインストールされている深部組織のイメージングと外部検出器に最適化されています。オリンパスLUMPlan FL / IR 20X/0.95NAの対物レンズが使用されます。 0.9％生理食塩水は、客観的な浸水のための画像処理時に使用されます。
- 明るく標識したニューロンを含む領域を識別するこの顕微鏡を使用して、低デジタルズーム（× 1）。
- 顕微鏡の接眼部に固定されたデジタルカメラを使用して、撮像領域の写真を撮る。また、血液の血管パターンの概略を述べる。これは、再することが必要ですその後の時点で同一の撮像位置に回します。
- 樹枝状分岐の程度を示す脳の全体の可視範囲（通常は〜200μmをスパニング）を介して、低倍率のスタック（5μmのステップX20の目標、512 × 512ピクセル）を取得。注：この低倍率の画像は、血管や樹状突起の両方が若く、成熟した動物で、その構造を維持するとして、その後の時点でのイメージング領域を見つけるために使用されます。
- イメージングソフトウェア（Fluoview、V. 5.0、FV300）を使用して、8倍デジタル倍率を増加させる。 X、Y座標（パン座標）を必要に応じて調整し、場所と樹状突起棘の構造を含む、詳細な樹枝状形態が表示されます高倍率のスタックを収集する。各スタックコレクション、すなわちパン座標、コレクション、Z -ステップサイズおよびスタック内のステップ数の範囲についての詳細なメモを取る。その後の時点で、この樹状突起や軸索に戻るときにこれらのノートは使用されます。
- イメージングの後、静かに頭蓋骨の表面から板を分離することにより、ヘッドプレートを取り外します。鉗子を使用して、頭蓋骨に残った残留接着剤を除去し、0.9％滅菌生理食塩水で頭蓋骨の表面を拭いてください。 ＃6の縫合糸を使用して一緒に頭蓋骨を介して皮膚を縫合。 70％エタノールでエリアを拭いてください。手術後の回復中に痛みを軽減するために、0.1 mg / kgのブプレノルフィンの鎮痛、SQを管理する。
- それが起動して、モバイルになるまで加熱ランプの下できれいなケージで動物を置きます。オリジナルのケージに動物を返します。
- 後の時点でのイメージを再作成の動物（私たちの撮影時間のポイントが離れて2日から何ヶ月にどこでも構いません）に、ステッチを削除するか、上記のような無菌の方法を使って頭の上に皮膚を再び開きます。元画像の場所を見つけるために脳血管系（最初の手術の日に撮影）のデジタル画像を使用してください。 Reaffixステンレス鋼headplate（ステップ10-12）。撮影時間の点の間に再成長している可能性のある骨離れて静かに薄いために顕微ブレードを使用してください。歯科用ドリルで薄い、必要に応じて。明確なイメージング破片のウィンドウと0.9％滅菌生理食塩水の滴を適用する。
- 二光子顕微鏡に動物を運ぶと、元画像のフィールドを探します。援助のための最初のイメージングセッション中に撮影されたデジタル写真を使用してください。
- Fluoviewプログラムを開き、元の低倍率の画像を開きます。貼って、コンピュータの画面に透明シートや透明性のペンを使用して主要な血管のパターンをスケッチ。
- ライブ画像を開いて、透明フィルム上にスケッチパターンへの血液の血管系を再調整してください。
- 構造にズームイン8倍速のイメージを再作成するには、以前のイメージングセッションから目的収集したスタックを開く。コンピュータの画面に貼付透明フィルム上に構造を（グリア、樹状突起、軸索すなわち）、スケッチ。
- ライブイメージから8倍速でのズームとパンを設定するには、初日のイメージングパラメータに変換します。低倍率の位置を揃えるの精度に応じて、それはまた、若干画像の角度を調整する必要があります。所望の構造が発見されると、あなたのスケッチ高倍率のパターンに構造を一致させる。その後の分析のためのZスタック画像の同一のステップの大きさと数でz -スタックを収集する。
- すべての高倍率の画像が再収集されるまで、手順29と30を繰り返します。
- イメージングが完了したら、手順22から24を繰り返します。再イメージングは、2つの独立した時点にでまで繰り返すことができる。
- 動物実験は、実験動物のケアの評価と認定のために協会が完全な認定で、医学と歯学のロチェスター大学大学の実験動物医学のビバリウムと部門が定めたガイドラインと規則に従って行われた州法、連邦法及びNIHのポリシーに準拠して国際的な（AAALAC）となります。
代表的な結果
GFP - M発現マウスでは、層5錐体細胞とそれに対応する樹状突起のサブセットは容易に2光子レーザー走査顕微鏡（2PLSM）1を用いて可視化することができます。ここでは、目的の画像の位置上の頭蓋骨が〜10から30ミクロンまで薄くされている間伐-頭蓋骨の準備を示した。正しく実行される、我々のプロトコルは、私たちは明らかに急性または慢性の分析（図2）のための完全な視覚野における皮質の樹状突起と棘を可視化することができました。
図1。カスタムヘッドとベースプレート。間伐-頭蓋骨の手術の準備のために使用されるカスタムメイドのヘッドとベース板の（）上から見た図。カスタムメイドの頭部と底板の（B）は側面図。 （C、D）ヘッドプレートの詳細な回路図と画像。
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Discussion
二光子顕微鏡を用いて慢性的なイメージングは、可塑性2-5時にトリガーの形態学的変化を研究するためにますます一般的な手法になりつつあります。ここでは、異なる画像間で無傷のマウス脳内の識別された樹状突起に従うことを間伐-頭蓋骨の準備を示しています。このプロトコルでは、頭蓋骨は皮質への最小限の損傷を引き起こし、脳の機能6を変える可能性の神経炎症の非常に低いレベルで、その結果、そのまま残されます。これは、動物はすぐに最初の手術後にしてから数年後に続いてイメージを再作成日イメージングすることができます。これは強力なテクニックですが、にも限界があります。頭蓋ウィンドウがクリアされている間に開頭し、それゆえ関連するグリアの活性化を伴う、より侵襲的なウィンドウの準備は、イメージングのセッションの任意の数と脳の繰り返しイメージングすることができます。薄い頭蓋骨の準備は、しかし、マウスの皮膚を開閉に関わる手術のために最大で3つの画像のセッションに制限されています。さらに、深さの浸透は、頭蓋ウィンドウ2に優れています。慢性的なイメージング実験のための外科的アプローチを決定する際には慎重に検討するため、注意が必要です。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、医歯薬学総合研究のバロウズウェルカムのキャリア賞（AKM）、ホワイトホール財団研究助成（AKM）、スローン財団フェローシップ（AKM）、NIH EY019277（AKM）、および資金NEI、ビジョントレーニンググラント、EY013319（によってサポートされていましたEAK）。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| Medetomindine Hydrochloride | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| Midazolam HCL | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| 2,2,2-tribrom–thanol | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1% |
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| 2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%) | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775% |
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| TC-1000 Temp. Control System for Mice | CWE, Inc. | TC-1000 Mouse | Body Temp. Regulation | |
| Toberadex | In House | Eye Ointment | ||
| 10% Ferric Chloride | Ricca Chemical Company | 3120-32 | Thin-skull preparation | |
| Microsurgical Blade | Sable Industries | S-6400 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 404,401 | Loctite | P/N 46551 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 401 | Loctite | P/N 40140 | Thin-skull preparation | |
| Zip Kicker Glue Accelerator | Pacer Technology | PT-29 | Thin-skull preparation | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | Thin-skull preparation | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Thin-skull preparation | |
| #6-0 (0.7 metric ) silk suture | Ethicon Inc. | K8894H | Taper C-1 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11000-12 |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
