Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Хронический изображений Мыши зрительной коры Использование тоньше черепа-подготовка

Published: October 25, 2010 doi: 10.3791/2060

Summary

В этом материале видео и дополнительные, мы показываем протокол для хронических

Abstract

В естественных изображений с помощью двух-фотонной микроскопии лазерного сканирования (2PLSM) позволяет изучения живых клеток и нейронов процессов в интактном мозге. Техники, представленные здесь позволяет изображений одного и того же область мозга, в нескольких точках времени (хронический изображений) с микроскопическими разрешение позволяет отслеживания дендритных шипиков, которые являются мелкими структурами, которые представляют большинство возбуждающих постсинаптических сайтов в ЦНС. Способность четко решать штраф корковых структур в течение нескольких моментов времени имеет много преимуществ, в частности, в изучении пластичности мозга, в которых морфологические изменения в синапсах и схема реконструкции может помочь объяснить основные механизмы. В этом материале видео и дополнительные, мы показываем протокол для хронических в естественных изображений нетронутыми мозга с помощью разбавленной-череп подготовки. В разреженных черепа препарата минимально инвазивных подход, который позволяет избежать потенциального повреждения твердой мозговой оболочки и / или коры, снижая тем самым начало воспалительного ответа. При этом протокол выполняется правильно, то можно четко отслеживать изменения в характеристики дендритных позвоночника в интактном мозге в течение длительного периода времени.

Protocol

  1. Для визуализации нейронов в интактном мозге при помощи двух-фотонной микроскопии, подготовка которых нейроны помечены флуоресцентными маркерами используется. В экспериментах, представленные здесь мы используем GFP-М трансгенных мышей линии, которая этикетки слой 5 пирамидальные клетки 1. Уровень 5 пирамидальные клетки проекта дендритные процессы в поверхностных слоях, что позволяет визуализации дендритов и дендритных шипиков на глубину до 300 мкм ниже уровня Пиа. Альтернативный подход заключается в этикетке клеток с использованием вирусных маркеров (см. Лоури и соавт., Представленный на Юпитер).
  2. Стерилизовать рабочей области, используя 70% этанола и автоклава инструменты для асептической хирургии. Крышка рабочей поверхности чистой повязки.
  3. Обезболить мышей с Фентанил коктейль (фентанил 0,05 мг / кг, мидазолам 5 мг / кг; metatomadin 0,5 мг / кг), а затем на четверть дозы Avertin (0,0075 мг / мл), используя IACUC утвержденными процедурами. Предварительной обработки мышей с обезболивающим, бупренорфин (0,5 мг / кг) подкожно (SQ). Монитор уровня плоскости анестезии, проверяя реакцию на хвост / ног крайнем случае.
  4. Поддерживать животных на 37,5 ° С с использованием нагрева одеяло с прикрепленными ректального термометра.
  5. Применение глазной мази для глаз, чтобы предотвратить глаз от высыхания. Худа глаза с небольшими лист бумаги, чтобы защитить глаза от источника света во время операции.
  6. Использование ножницы, удалить волосы из задней части головы (за ушами), чтобы глаза.
  7. Чистая верхней части головы животного с последовательным применением 70% этанола, а затем скраб бетадин и бетадин решение.
  8. Сделать L-вырезать разрез за ушами и вдоль правой или левой стороны от средней линии (в зависимости от полушария будут в образ), чтобы глаза. Сложите кожу над и далеко от хирургии сайта. Не снимайте кожу, как кожа будет зашивается следующих изображений сессии.
  9. Использование тонких щипцов осторожно потяните кожу вверх и в сторону от вашей области интересов.
  10. Аккуратно соскрести надкостницы от пораженном участке черепа чистой щипцов или микрохирургических лезвия. Использование ватным тампоном, нанесите небольшое количество на 10% хлорида железа к черепу, чтобы полностью высохнуть надкостницы мембраны и убедитесь, что она была удалена полностью. Важно, что череп полностью высохнет для обеспечения надлежащего склеивание клеем (см. 11). Использование щипцов или микрохирургические лезвия, осторожно соскрести сухой надкостницы мембраны.
  11. Нанесите тонкий слой клея цианоакрилат вокруг изображения окна пластиной из нержавеющей стали головой (см. Рисунок 1) и прикрепить пластину к черепу.
  12. Использование деревянных конце хлопка тампон, палки, нанесите клей на швы внутри изображения окна, убедившись, чтобы заполнить все пробелы между пластиной с изображениями и кривизны черепа.
  13. Место каплю клея ускорителя в окно. Быстро вытереть избыточного ускоритель клея с помощью ватного тампона или Ким салфеткой. Клей должен быть полностью затвердевших до сверления.
  14. Начать тонкий череп в изображение окна с помощью бормашины заверенные 0,7 мм из нержавеющей стали заусенцев. Альтернативные бурения с редкими применения 0,9% стерильного физиологического раствора, чтобы избежать создания слишком много тепла, на черепе.
  15. Тонкие окна 4х4 мм на черепе с помощью небольших ударов по всей поверхности черепа с бормашины. Испытание тонкость череп с тупого конца пинцетом. Поверхности черепа будет отступа немного с легким нажимом. Оптимальная толщина для работы с изображениями черепа составляет от 10 до 30 мкм.
  16. Когда череп тонкий и окна очистить от всех мусора, место солевой на черепе. Фотографии изображений окно с цифровой камеры, установленной на вскрытии области. Фотография и использование мозга сосудистой поможет в поиске позиции для размещения изображений пластина для последующих сессий визуализации.
  17. Транспорт животным 2-фотон буровой установки. Животное должно оставаться на обогрев одеяло (с зондом ректальной) в течение всего сеанса визуализации. Обратите внимание: в то время под действием успокоительного, составляющего ядро ​​животного температура будет колебаться значительно, в отсутствие нагревательного элемента в результате повреждения или коры, возможно, смерть.
  18. Двухфотонного микроскопа с Mai Tai лазер, 10W твердом состоянии насос для максимальной мощности и изменение Olympus Fluoview конфокальной устройство используется. Система оптимизирована для глубокого изображения тканей и внешних детекторов установлены как можно ближе к цели, как можно разрешить максимального обнаружения флуоресценции от мозга. Olympus FL LUMPlan / IR 20X/0.95NA объектива используется. 0,9% физиологического раствора используется во время съемки для целей погружения.
  19. С помощью этого микроскопа, и низкий цифрового зума (x1) определить области, содержащей ярко меченых нейронов.
  20. Использование цифровой камеры, прикрепленной к глазу кусок микроскоп, сфотографировать изображение области. Кроме того, обрисовать картину крови сосудов. Это необходимо для повторногосвою очередь, в той же папке изображений с последующей временной точке.
  21. Получить низким стек увеличением (х20 цели, 512x512 пикселей, 5 мкм, шаг) через весь видимый масштаб мозга (как правило, охватывает около 200 мкм), показывающие степень дендритные ветвления. Примечание: это низкое увеличение изображения будет использоваться для поиска изображений область в последующие моменты времени, как и кровеносные сосуды и дендриты сохранить свою структуру в молодых и взрослых животных.
  22. Использование для обработки изображений (Fluoview, v. 5.0, FV300), повышение цифровым увеличением в 8 раз. Настройка X, Y координаты (панорамирование координаты) в случае необходимости и собрать высокий стек увеличение, которое покажет подробную дендритных морфологии в том числе мест и структуры дендритных шипиков. Возьмите подробные записи о каждом стеке сбора, то есть кастрюля координаты, диапазон сбора, Z-шаг размер и количество шагов в свой стек. Эти записи будут использоваться при возвращении к этому дендрита или аксона в последующие момент времени.
  23. После обработки изображений, удалить голову пластину, аккуратно разделяющей пластины от поверхности черепа. Использование щипцов, удалить остатки клея, оставшиеся на черепе и протрите поверхности черепа с 0,9% стерильного физиологического раствора. Шовный кожу над черепом вместе, используя # 6 сшивания потока. Протрите область с 70% этанола. Чтобы облегчить боль во время послеоперационной реабилитации, администрирования 0,1 мг / кг Бупренорфин болеутоляющее, SQ.
  24. Место животных в чистой клетке под лампой тепло, пока он не проснется и мобилен. Вернуться животное оригинальной клетки.
  25. Для Reimage животных на более позднем этапе (наши точки изображения времени может быть от 2 дней до нескольких месяцев друг от друга), удалите стежки или возобновить кожу на голове с использованием асептических методов, что и выше. Использование цифрового изображения головного мозга сосудистой (взято на первом свидании хирургии), чтобы найти исходное расположение изображения. Reaffix нержавеющей стали headplate (шаги 10-12). Использование микрохирургической лезвием аккуратно тонкую далеко любые кости, которые могли быть повторно вырос между точками изображения времени. В случае необходимости, с тонкими бормашины. Прозрачное окно изображения от мусора и применять капли 0,9% стерильного физиологического раствора.
  26. Carry животное двухфотонного микроскопа и найти исходное поле изображения. Использование цифровой фотографии, сделанной во время первой сессии изображений для получения помощи.
  27. Открытое Fluoview программу и открыть исходный низкий увеличения изображения. Прикрепите прозрачности листа на экран компьютера и эскиз картины основных кровеносных сосудов использованием прозрачности пера.
  28. Открытое Изображение в реальном времени и перестроить крови к сосудистой набросал рисунок на прозрачной пленке.
  29. Для Reimage 8x увеличено структур, откройте желаемый собраны стек от предыдущей сессии изображений. Очерк структуры (т.е. аксонального, дендритные, глиальные) на прозрачной пленке, прикрепленной к экрану компьютера.
  30. Увеличить 8x от живого изображения и установить кастрюлю координаты первые параметры визуализации день. В зависимости от точности выравнивания низкое расположение увеличение, это может быть необходимо также отрегулировать угол изображения незначительно. Как только желаемую структуру найден, совпадают структуру вашего рисовал картины высоких увеличениях. Сбор Z-Stack с одинаковым размером шага и номер Z-Stack изображения для последующего анализа.
  31. Повторите шаги 29 и 30, пока все изображения с высоким увеличением повторно собираются.
  32. При визуализации завершена, повторите шаги 22-24. Re-изображений может быть повторен на скорости до 2 отдельные моменты времени.
  33. Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Виварий и отдела лабораторных животных медицины Университета Рочестера школы медицины и стоматологии, в полной аккредитации Ассоциации оценке и аккредитации лаборатории по Уходу за животными, International (AAALAC) и в соответствии с государственным законом, федеральным законом и NIH политики.

Представитель Результаты

В GFP-М выразив мышей, подмножество слоя 5 пирамидальные клетки и соответствующие дендритные процессы могут быть легко визуализированы с помощью 2-фотонный лазерной сканирующей микроскопии (2PLSM) 1. Здесь мы показали в разреженных черепа подготовки, в которой череп желаемое расположение изображений сокращается до ~ 10-30 мкм. Выполнены правильно, наш протокол позволил четко визуализировать корковых дендритов и шипы в интактном зрительную кору острой или хронической анализа (рис. 2).

Рисунок 1
Рисунок 1. Custom голова и опорной плиты. () Вид сверху на заказ голова и основание для разреженных черепа операции подготовки. (B) Вид сбоку на заказ голову и опорной плиты. (C, D) Подробные схемы и изображение головы пластинку.

Рисунок 2
в естественных условиях в зрительной коре трансгенных GFP-М мыши с помощью двух-фотонной микроскопии. Изображение является проекцией одного изображения, полученного через каждые 5 мкм от мягкой до конечной глубине 175 мкм. Коробках область в увеличенном представляет регион в (Б) и (С) отображается на день 0 (D0) и четыре дня спустя (D4). (D, E) Высшее увеличение дендритные ветви загнала вас в угол В и С демонстрируют стабильный шипами (белые наконечники стрел), потеряли / сворачивания шипами (красный наконечники стрел) и новые шипы (руководители зеленая стрелка). Шкала баров = А. 200 мкм, B, C. 20 мкм, D, Е. 5 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хронический визуализации с использованием двухфотонного микроскопии становится все более популярной техникой для изучения морфологических изменений, вызванных в течение 2-5 пластичности. Здесь мы показываем, в разреженных черепа подготовки следовать определены дендритных шипиков в интактном мозге мышей в разные дни изображений. В этом протоколе черепа остается без изменений, что приводит к минимальным повреждением мозга и приводит к очень низким уровням neuroinflammation которые могут изменить функцию мозга 6. Это позволяет животному для включения в образ сразу же после первой операции, а затем впоследствии reimaged дней до нескольких лет позже. Это мощная техника, но также имеет свои ограничения. Более инвазивных окна препарат, который включает в себя трепанации черепа и, следовательно, связанные глиальных активации, позволяет повторять визуализации мозга с произвольным количеством изображений сессий в то время как черепных окна ясно. Подготовки тонких черепа, однако, ограничивается не более трех изображений сессиях, поскольку участвует в операции открытия и закрытия кожи мыши. Кроме того, глубина проникновения является более совершенным в черепной 2 окна. Особое внимание должно быть принято при принятии решения хирургического подхода при хронических экспериментов изображений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Burroughs Wellcome Карьера премии в области медико-биологических наук (АКМ), Уайтхолл исследовательского фонда Грант (АКМ), Слоан стипендии Фонда (АКМ), NIH EY019277 (АКМ) и НОУ финансируется, Видение Обучение Грант, EY013319 ( ЕАК).

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fentanyl Citrate In House Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail;
IP Dose: 0.0125 ml/g

Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Medetomindine Hydrochloride In House Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail;
IP Dose: 0.0125 ml/g

Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Midazolam HCL In House Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail;
IP Dose: 0.0125 ml/g

Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribrom–thanol Avertin Cocktail: Anesthetic;
IP Dose: 0.0075 cc/ g

Final cocktail conc.: 1%
2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%) Avertin Cocktail: Anesthetic;
IP Dose: 0.0075 cc/ g

Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 Temp. Control System for Mice CWE, Inc. TC-1000 Mouse Body Temp. Regulation
Toberadex In House Eye Ointment
10% Ferric Chloride Ricca Chemical Company 3120-32 Thin-skull preparation
Microsurgical Blade Sable Industries S-6400 Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 404,401 Loctite P/N 46551 Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 401 Loctite P/N 40140 Thin-skull preparation
Zip Kicker Glue Accelerator Pacer Technology PT-29 Thin-skull preparation
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter Fine Science Tools 19008-07 Thin-skull preparation
Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece Ram Products, Inc. TECH2000ON/OFF Thin-skull preparation
#6-0 (0.7 metric ) silk suture Ethicon Inc. K8894H Taper C-1
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved Surgical Tools Fine Science Tools 11152-10
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm Surgical Tools Fine Science Tools 14084-08
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm Surgical Tools Fine Science Tools 11000-12

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  2. Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  3. Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
  4. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
  5. Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  6. Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).

Tags

Neuroscience выпуск 44 в разреженных черепа двухфотонной микроскопии зрительной коре дендритов работы с изображениями
Хронический изображений Мыши зрительной коры Использование тоньше черепа-подготовка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kelly, E. A., Majewska, A. K.More

Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (44), e2060, doi:10.3791/2060 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter