Summary
इस वीडियो और पूरक सामग्री में, हम पुरानी लिए एक प्रोटोकॉल दिखा
Abstract
दो photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (2PLSM) का उपयोग vivo इमेजिंग में रहने वाले बरकरार मस्तिष्क कोशिकाओं और neuronal प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है. यहाँ प्रस्तुत तकनीक सूक्ष्म वृक्ष के समान spines जो छोटे संरचनाओं कि CNS में postsynaptic उत्तेजक साइटों के बहुमत का प्रतिनिधित्व करते हैं रहे हैं पर नज़र रखने की अनुमति संकल्प के साथ कई बार अंक (पुरानी इमेजिंग) में मस्तिष्क के एक ही क्षेत्र के इमेजिंग की अनुमति देता है. स्पष्ट रूप से कई बार अंक पर ठीक cortical संरचनाओं को सुलझाने की क्षमता कई फायदे हैं, विशेष रूप से मस्तिष्क plasticity में जो synapses और सर्किट remodeling के morphological परिवर्तन मदद मिल सकती है अंतर्निहित तंत्र को समझाने के अध्ययन में. इस वीडियो और पूरक सामग्री में, हम बरकरार मस्तिष्क का उपयोग कर एक thinned - खोपड़ी तैयारी के vivo इमेजिंग में जीर्ण के लिए एक प्रोटोकॉल है दिखाते हैं . तैयारी thinned खोपड़ी एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण है, जो dura और / या प्रांतस्था संभावित क्षति से बचा जाता है, इस प्रकार एक भड़काऊ प्रतिक्रिया की शुरुआत को कम करने है. जब इस प्रोटोकॉल सही ढंग से किया जाता है, यह संभव है करने के लिए स्पष्ट रूप से समय की एक लम्बी अवधि में बरकरार मस्तिष्क में वृक्ष के समान रीढ़ की विशेषताओं में परिवर्तन की निगरानी.
Protocol
- बरकरार दो photon माइक्रोस्कोपी, एक तैयारी है जहां न्यूरॉन्स फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ लेबल रहे हैं का उपयोग कर मस्तिष्क में न्यूरॉन्स की कल्पना प्रयोग किया जाता है. प्रयोगों में यहाँ प्रस्तुत हम GFP-M ट्रांसजेनिक माउस लाइन जो परत 5 पिरामिड कोशिकाओं एक लेबल का उपयोग करें. सतही परतों में परत 5 पिरामिड कोशिकाओं वृक्ष के समान प्रक्रियाओं परियोजना, पिया के स्तर से नीचे 300 सुक्ष्ममापी की गहराई dendrites और वृक्ष के समान spines के दृश्य की अनुमति. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण लेबल वायरल मार्कर (Lowery एट अल देखें. जौव के लिए प्रस्तुत) कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए है.
- सड़न रोकनेवाला सर्जरी के लिए 70% इथेनॉल और आटोक्लेव उपकरण का उपयोग कार्यक्षेत्र जीवाणुरहित. साफ ड्रेसिंग के साथ सतह ऑपरेटिंग कवर.
- Avertin की एक चौथाई खुराक (०.०,०७५ मिलीग्राम / एमएल) IACUC अनुमोदित प्रक्रियाओं का उपयोग द्वारा पीछा किया. Fentanyl कॉकटेल (; midazolam 5 मिलीग्राम / किग्रा metatomadin 0.5 मिलीग्राम / किग्रा fentanyl 0.05 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों anesthetize एनाल्जेसिक के साथ चूहों pretreat, buprenorphine (0.5 मिलीग्राम / किग्रा) subcutaneously प्रशासित (वर्ग). पूंछ / पैर के अंगूठे चुटकी परीक्षण प्रतिक्रिया द्वारा संवेदनाहारी विमान के स्तर मॉनिटर.
- 37.5 पर पशु बनाए रखें डिग्री सेल्सियस संलग्न गुदा थर्मामीटर के साथ हीटिंग कंबल का उपयोग कर.
- आंखों को नेत्र मरहम लागू करने के लिए बाहर सुखाने से आंखों को रोकने के. कागज के छोटे पत्र के साथ हूड आँखों प्रकाश स्रोत से सर्जरी के दौरान आंखों की रक्षा.
- कैंची का प्रयोग, सिर के पीछे (कान के पीछे) से बाल आंखों को निकालने.
- साफ अनुक्रमिक आवेदन के साथ 70% इथेनॉल के पशु के सिर के ऊपर, betadine साफ़ और betadine समाधान द्वारा पीछा किया.
- या तो आंखों को midline (निर्भर करता है गोलार्द्ध जो imaged किया जाएगा) के दाईं या बाईं ओर के साथ कान और एल कटौती के पीछे एक चीरा बनाओ. त्वचा मोड़ो और सर्जरी साइट से दूर है. हटाने के रूप में त्वचा इमेजिंग सत्र के बाद sutured नहीं किया जाएगा त्वचा.
- ठीक संदंश का प्रयोग धीरे त्वचा खींच कर और ब्याज की अपने क्षेत्र से दूर.
- धीरे साफ संदंश या microsurgical ब्लेड के साथ खोपड़ी के उजागर क्षेत्र से दूर periosteum परिमार्जन. कपास झाड़ू का प्रयोग, खोपड़ी के लिए 10% Ferric क्लोराइड की एक छोटी राशि लागू करने के लिए पूरी तरह से periosteum झिल्ली सूखी और सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से हटा दिया गया है. यह महत्वपूर्ण है कि खोपड़ी गोंद का उचित पालन को सुनिश्चित करने (11 देखें) पूरी तरह से सूखा है. संदंश या microsurgical ब्लेड का प्रयोग, धीरे सूख दूर periosteum झिल्ली परिमार्जन.
- स्टेनलेस स्टील सिर प्लेट (चित्रा 1 देखें) और खोपड़ी के लिए थाली प्रत्यय के इमेजिंग खिड़की के आसपास cyanoacrylate गोंद की एक पतली परत लागू करें.
- एक कपास झाड़ू से साफ़ करना छड़ी की लकड़ी के अंत का प्रयोग, इमेजिंग खिड़की के अंदर तेजी से गोंद लागू होते हैं, इमेजिंग थाली और खोपड़ी की वक्रता के बीच अंतराल को भरने सुनिश्चित करने.
- विंडो में गोंद त्वरक की एक बूंद रखें. जल्दी दूर के साथ एक कपास झाड़ू या किम पोंछ अतिरिक्त गोंद त्वरक पोछ लो. गोंद पूरी तरह से ड्रिलिंग से पहले जम होना चाहिए.
- इमेजिंग एक दंत ड्रिल एक 0.7 मिमी स्टेनलेस स्टील गड़गड़ाहट के साथ चिपका का उपयोग कर खिड़की में खोपड़ी पतली शुरू करो. 0.9% की बाँझ खारा के सामयिक आवेदन के साथ वैकल्पिक ड्रिलिंग खोपड़ी पर बहुत ज्यादा गर्मी पैदा करने से बचने के लिए.
- पतला दंत ड्रिल के साथ खोपड़ी की सतह भर में छोटे स्ट्रोक का उपयोग खोपड़ी पर एक 4x4 मिमी खिड़की. कुंद अंत संदंश के साथ खोपड़ी के thinness टेस्ट. खोपड़ी की सतह से थोड़ा कोमल दबाव के साथ इंडेंट जाएगा. इमेजिंग के लिए इष्टतम खोपड़ी मोटाई के बीच 10 और 30 सुक्ष्ममापी है.
- जब खोपड़ी पतली है और खिड़की सभी मलबे का साफ, खोपड़ी पर खारा जगह है. एक डिजिटल कैमरा के साथ एक विदारक गुंजाइश मुहिम शुरू इमेजिंग विंडो तस्वीर. और मस्तिष्क vasculature की फोटोग्राफ़ी और उपयोग के बाद इमेजिंग सत्र के लिए इमेजिंग थाली जगह की स्थिति का पता लगाने में सहायता करेगा.
- 2-photon रिग करने के लिए पशु परिवहन. पशु हीटिंग कंबल (रेक्टल जांच के साथ) पर पूरे इमेजिंग सत्र के दौरान रहना चाहिए. नोट: जबकि बेहोश करने की क्रिया के तहत, जानवर के मुख्य शरीर का तापमान बहुत cortical क्षति या संभवतः मौत में जिसके परिणामस्वरूप एक हीटिंग इकाई के अभाव में उतार चढ़ाव हो जाएगा.
- एक माई ताई लेजर, एक 10W अधिकतम शक्ति और एक संशोधित ओलिंप FluoView confocal इकाई के लिए ठोस राज्य पंप के साथ एक दो photon माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया है. गहरी ऊतक इमेजिंग प्रणाली के लिए अनुकूलित है और बाहरी डिटेक्टरों उद्देश्य के लिए करीब के रूप में स्थापित कर रहे हैं संभव के रूप में मस्तिष्क से प्रतिदीप्ति की अधिक से अधिक का पता लगाने की अनुमति है. ओलिंप LUMPlan / fl आईआर 20X/0.95NA उद्देश्य लेंस प्रयोग किया जाता है. 0.9% खारा उद्देश्य डुबकी के लिए इमेजिंग के दौरान प्रयोग किया जाता है.
- इस सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, और कम डिजिटल ज़ूम (x1) एक चमकीले लेबल न्यूरॉन्स वाले क्षेत्र की पहचान.
- एक डिजिटल कैमरा खुर्दबीन आँख का टुकड़ा चिपका का उपयोग, इमेजिंग क्षेत्र के एक तस्वीर ले लो. वैकल्पिक रूप से, रक्त vasculature पैटर्न स्केच. यह पुनः के लिए आवश्यक हैबाद में एक समय बिंदु पर एक ही इमेजिंग स्थान पर बारी.
- मस्तिष्क वृक्ष के समान उपशाखा की हद दिखा (आमतौर पर ~ 200 सुक्ष्ममापी फैले) के पूरे दृश्य हद के माध्यम से, एक कम बढ़ाई ढेर (5 सुक्ष्ममापी कदम x20 उद्देश्य, 512x512 पिक्सेल) प्राप्त करते हैं. नोट: यह कम बढ़ाई छवि के बाद समय बिंदुओं पर इमेजिंग क्षेत्र का पता लगाने के लिए दोनों के रूप में रक्त वाहिकाओं और dendrites युवा और वयस्क पशुओं में उनकी संरचना को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर (FluoView, वी. 5.0, FV300) का उपयोग, डिजिटल बढ़ाई 8 गुना वृद्धि हुई है. एक्स, वाई निर्देशांक (पैन निर्देशांक) यदि आवश्यक समायोजित करें और एक उच्च बढ़ाई ढेर जो स्थानों और वृक्ष के समान spines की संरचना सहित विस्तृत वृक्ष के समान आकारिकी दिखाएगा एकत्र. प्रत्येक ढेर संग्रह, अर्थात् पैन निर्देशांक संग्रह z कदम, आकार और अपने ढेर में कदम की संख्या की सीमा के बारे में विस्तृत नोट ले लो. ये नोट जब इस या बाद में एक समय बिंदु पर dendrite अक्षतंतु लौटने इस्तेमाल किया जाएगा.
- इमेजिंग के बाद, धीरे खोपड़ी की सतह से अलग प्लेट द्वारा सिर थाली हटा. संदंश का प्रयोग, किसी भी अवशिष्ट खोपड़ी पर शेष गोंद हटाने और 0.9% बाँझ खारा के साथ खोपड़ी की सतह पोंछ. साथ खोपड़ी # 6 suturing धागे का उपयोग अधिक त्वचा सीवन. 70% इथेनॉल के साथ क्षेत्र को साफ कर लें. पोस्ट ऑपरेटिव वसूली के दौरान दर्द कम करने के लिए, 0.1 buprenorphine मिलीग्राम / किग्रा एनाल्जेसिक, वर्ग प्रशासन.
- एक गर्मी दीपक के नीचे रखें जब तक यह साफ पिंजरे में पशु जाग और मोबाइल है. मूल पिंजरे जानवर लौटें.
- एक बाद में समय बिंदु (हमारे इमेजिंग समय अंक 2 दिनों से कहीं भी कई अलग महीनों के लिए किया जा सकता है) पर जानवर reimage टाँके हटाने या इसके बाद के संस्करण के रूप में सड़न रोकनेवाला तरीकों का उपयोग कर सिर पर त्वचा को फिर से खोलना. मस्तिष्क vasculature (पहली सर्जरी तारीख पर लिया) की डिजिटल छवि का प्रयोग इमेजिंग मूल स्थान का पता लगाने के लिए. Reaffix स्टेनलेस स्टील headplate (10-12 कदम). धीरे दूर हो सकता है कि इमेजिंग समय अंक के बीच फिर हो किसी भी हड्डी पतली microsurgical ब्लेड का प्रयोग करें. यदि आवश्यक हो, दंत ड्रिल के साथ पतली. मलबे का साफ इमेजिंग खिड़की और 0.9% की बाँझ खारा के एक बूंद लागू होते हैं.
- दो photon माइक्रोस्कोप जानवर कैर्री और मूल इमेजिंग के क्षेत्र का पता लगाने. डिजिटल सहायता के लिए पहली इमेजिंग सत्र के दौरान लिया तस्वीर का उपयोग करें.
- FluoView कार्यक्रम खोलें और मूल कम बढ़ाई छवि खुला. प्रत्यय पारदर्शिता कंप्यूटर स्क्रीन और संक्षिप्त वर्णन करने के लिए पत्रक प्रमुख रक्त वाहिका पारदर्शिता पेन का उपयोग पैटर्न.
- लाइव छवि को खोलें और पारदर्शिता फिल्म पर sketched पैटर्न के लिए रक्त के vasculature को फिर से संगठित करना.
- 8x reimage संरचनाओं में तेजी से बढ़ी, पिछले इमेजिंग सत्र से वांछित एकत्र ढेर खुला. (यानी axonal, वृक्ष के समान, glial) संरचना एक पारदर्शिता फिल्म पर कंप्यूटर स्क्रीन पर चिपका स्केच.
- 8x में लाइव छवि से ज़ूम और पैन सेट पहले दिन इमेजिंग पैरामीटर के लिए निर्देशांक. कम बढ़ाई स्थान aligning की सटीकता पर निर्भर करता है, यह आवश्यक हो भी थोड़ा छवि के कोण समायोजित कर सकते हैं. एक बार इच्छित संरचना पाया जाता है, अपने sketched उच्च बढ़ाई पैटर्न संरचना मैच. समान कदम है और बाद के विश्लेषण के लिए z ढेर छवियों के आकार और संख्या के साथ z ढेर लीजिए.
- 29 और 30 चरणों को दोहराएँ जब तक सभी उच्च बढ़ाई छवियों को फिर से एकत्र कर रहे हैं.
- जब इमेजिंग पूरा हो गया है, दोहराने 22-24 कदम. पुन इमेजिंग में दोहराया जा सकता है है 2 अलग समय अंक.
- जानवरों पर प्रयोग मछली पालने का बाड़ा और प्रयोगशाला पशु चिकित्सा चिकित्सा और दंत चिकित्सा के रोचेस्टर विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ के के प्रभाग द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया, और प्रयोगशाला पशु देखभाल के आकलन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा पूर्ण मान्यता में, इंटरनेशनल (AAALAC) और राज्य के कानून, संघीय क़ानून और NIH नीति के साथ अनुपालन में हैं.
प्रतिनिधि परिणाम
GFP एम व्यक्त चूहों में, परत 5 पिरामिड कोशिकाओं और इसी वृक्ष के समान प्रक्रियाओं के एक सबसेट को आसानी से देखे जा 2-photon लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (2PLSM) 1 का उपयोग कर सकते हैं. यहाँ हम एक तैयारी thinned - खोपड़ी में जो वांछित इमेजिंग स्थान पर खोपड़ी ~ 10-30 सुक्ष्ममापी thinned है का प्रदर्शन किया. सही ढंग से प्रदर्शन किया, हमारे प्रोटोकॉल हमें स्पष्ट रूप से तीव्र या पुराना विश्लेषण (चित्रा 2) के लिए बरकरार दृश्य प्रांतस्था में cortical और dendrites कांटा कल्पना करने के लिए अनुमति दी.
चित्रा 1. कस्टम सिर और बेस प्लेट (ए) कस्टम मेड सिर और बेस प्लेट thinned - खोपड़ी सर्जरी की तैयारी के लिए इस्तेमाल का शीर्ष दृश्य . (बी) कस्टम बनाया सिर और बेस प्लेट के साइड दृश्य. (सी, डी) विस्तृत और सिर थाली के योजनाबद्ध छवि.
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Discussion
जीर्ण दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग रूपात्मक plasticity 2-5 के दौरान ट्रिगर परिवर्तन के अध्ययन के लिए एक तेजी से लोकप्रिय तकनीक बनता जा रहा है. यहाँ हम एक thinned - खोपड़ी अलग इमेजिंग दिन पर बरकरार माउस मस्तिष्क में वृक्ष के समान spines की पहचान का पालन तैयारी प्रदर्शित करता है. इस प्रोटोकॉल में, खोपड़ी बरकरार छोड़ दिया है, प्रांतस्था को न्यूनतम क्षति के कारण और neuroinflammation का स्तर बहुत कम है जो मस्तिष्क समारोह 6 को बदल सकता है जिसके परिणामस्वरूप में. यह जानवर पहले सर्जरी के बाद तुरंत और फिर साल के लिए बाद में reimaged दिनों बाद imaged अनुमति देता है. यह एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन यह भी अपनी सीमाएं हैं. अधिक आक्रामक खिड़की तैयारी है जो एक craniotomy और इसलिए जुड़े glial सक्रियण शामिल है, की अनुमति देता है इमेजिंग सत्र के एक मनमाना संख्या के साथ मस्तिष्क के दोहराने इमेजिंग जबकि कपाल खिड़की स्पष्ट है. पतली खोपड़ी तैयारी, हालांकि, ज्यादा से ज्यादा तीन इमेजिंग उद्घाटन और समापन माउस त्वचा में शामिल सर्जरी के लिए कारण सत्र तक ही सीमित है. इसके अतिरिक्त, गहराई पैठ कपाल 2 खिड़की में बेहतर है . इसलिए सावधानी से विचार जब पुरानी इमेजिंग प्रयोगों के लिए शल्य दृष्टिकोण तय करने के लिए लिया जाना चाहिए.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम बायोमेडिकल साइंसेज (AKM) में Burroughs Wellcome कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था (, व्हाइटहॉल फाउंडेशन अनुसंधान अनुदान (AKM), स्लोअन फाउंडेशन फैलोशिप (AKM), एनआईएच EY019277 (AKM), और एक Nei वित्त पोषित, विजन प्रशिक्षण अनुदान, EY013319 EAK).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| Medetomindine Hydrochloride | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| Midazolam HCL | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| 2,2,2-tribrom–thanol | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1% |
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| 2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%) | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775% |
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| TC-1000 Temp. Control System for Mice | CWE, Inc. | TC-1000 Mouse | Body Temp. Regulation | |
| Toberadex | In House | Eye Ointment | ||
| 10% Ferric Chloride | Ricca Chemical Company | 3120-32 | Thin-skull preparation | |
| Microsurgical Blade | Sable Industries | S-6400 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 404,401 | Loctite | P/N 46551 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 401 | Loctite | P/N 40140 | Thin-skull preparation | |
| Zip Kicker Glue Accelerator | Pacer Technology | PT-29 | Thin-skull preparation | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | Thin-skull preparation | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Thin-skull preparation | |
| #6-0 (0.7 metric ) silk suture | Ethicon Inc. | K8894H | Taper C-1 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11000-12 |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
