Summary
בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור כרונית
Abstract
בשנת vivo הדמיה באמצעות שני פוטונים לייזר מיקרוסקופיית (2PLSM) מאפשר לימוד של תאים חיים תהליכים עצביים במוח שלם. הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה של אותו אזור של המוח במספר נקודות זמן (הדמיה כרונית) עם רזולוציה מיקרוסקופי המאפשר מעקב של הקוצים הדנדריטים שהם מבנים קטנים המייצגים את רוב אתרי מעוררים postsynaptic במערכת העצבים המרכזית. היכולת בבירור לפתור מבנים קורטיקליים קנס על מספר נקודות זמן יש יתרונות רבים, במיוחד במחקר של פלסטיות המוח שבו שינויים מורפולוגיים על הסינפסות שיפוץ מעגל עשוי לעזור להסביר את המנגנונים. בחומר וידאו משלימים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור כרונית in vivo הדמיה של המוח שלם באמצעות הכנה דליל-הגולגולת. ההכנה סחוט הגולגולת היא גישה פולשנית, אשר ימנע נזק אפשרי ואת הדורה / או קליפת המוח, ובכך להקטין את תחילתה של תגובה דלקתית. כאשר בפרוטוקול זה מבוצע כהלכה, אפשר בבירור לעקוב אחר השינויים המאפיינים עמוד השדרה הדנדריטים במוח שלם על פני תקופה ממושכת.
Protocol
- כדי להמחיש את הנוירונים במוח שלם באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה, הכנה שבו הנוירונים מסומנים עם סמנים ניאון משמש. בניסויים שהוצגו כאן אנו משתמשים בקו ה-GFP-M עכבר מהונדס אשר תוויות שכבה 5 תאים פירמידליים 1. 5 שכבת תאים פירמידליים פרויקט תהליכים דנדריטיים לשכבות שטחיות, המאפשר ויזואליזציה של דנדריטים הקוצים הדנדריטים עד לעומק של 300 מיקרומטר מתחת לרמה של פיא. גישה חלופית היא להשתמש בתאים התווית סמנים ויראלי (ראה Lowery et al. שהוגשה יופיטר).
- לחטא את סביבת העבודה באמצעות אתנול 70% כלים החיטוי לניתוח aseptic. כיסוי משטח הפעלה עם רוטב נקי.
- הרדימי עכברים עם קוקטייל פנטניל (פנטניל 0.05 מ"ג / ק"ג; midazolam 5 מ"ג / ק"ג; metatomadin 0.5 מ"ג / ק"ג) ואחריו מנה רבע Avertin (0.0075 מ"ג / מ"ל) באמצעות נהלים שאושרו IACUC. Pretreat עכברים עם משכך כאבים, עצירות (0.5 מ"ג / ק"ג) מנוהל תת עורית (SQ). צג את רמת מטוס הרדמה מהתגובה בדיקות לצבוט זנב / הבוהן.
- שמירה על בעלי חיים 37.5 ° C באמצעות שמיכה חימום עם מדחום רקטלי המצורפת.
- החל משחה עיניים אל העיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות. הוד העיניים עם גיליון נייר קטנה כדי להגן על העיניים ממקור אור במהלך הניתוח.
- בעזרת מספריים, להסיר שיער מהחלק האחורי של הראש (מאחורי האוזניים) לעיניים.
- נקו את הראש של החיה עם יישום רציף של אתנול 70%, ואחריו לשפשף בבטאדין פתרון בבטאדין.
- בצע חתך L-לחתוך מאחורי האוזניים לאורך הצד או הימני או השמאלי של קו האמצע (תלוי באיזה חצי כדור תהיה הדמיה) לעיניים. מקפלים את העור מעל מהמקום הניתוח. אין להסיר עור כמו העור יהיה sutured בעקבות הפגישה הדמיה.
- בעזרת מלקחיים בסדר משוך בעדינות את העור כלפי מעלה והרחק מאזור העניין שלך.
- בעדינות לגרד ממנו את periosteum מאזור חשוף של הגולגולת עם מלקחיים נקי או להב microsurgical. בעזרת צמר גפן, מרחו כמות קטנה של כלוריד Ferric 10% הגולגולת לגמרי יבש הממברנה periosteum ולוודא כי הוא הוסר לחלוטין. חשוב הגולגולת יבש לחלוטין, כדי להבטיח שמירה נאותה של דבק (ראה 11). באמצעות מלקחיים או סכין microsurgical, בעדינות לגרד ממנו קרום periosteum יבשים.
- למרוח שכבה דקה של דבק cyanoacrylate סביב החלון הדמיה של צלחת ראש נירוסטה (ראה איור 1) ו להטביע את הצלחת לגולגולת.
- בעזרת קצה של מקל עץ כותנה מקלון, כדי להחיל דבק התפרים בתוך החלון הדמיה; לוודא למלא את כל הפערים בין הצלחת הדמיה העקמומיות של הגולגולת.
- מניחים טיפת דבק מאיץ לתוך החלון. במהירות למחות מאיץ דבק עודף עם מטלית כותנה או קים לנגב. הדבק צריך להיות מוצק לחלוטין לפני הקידוח.
- בגין דק את הגולגולת בחלון הדמיה באמצעות מקדח שיניים מודבקת עם 0.7 מ"מ נירוסטה בר. קידוח חלופית עם יישום מזדמנים של תמיסת מלח סטרילית 0.9%, כדי למנוע יצירת חום רב מדי על הגולגולת.
- חלון Thin 4x4 מ"מ בגולגולת באמצעות משיכות קטנות על פני השטח את הגולגולת עם המקדחה שיניים. בדוק את הרזון של הגולגולת עם מלקחיים סוף בוטה. פני הגולגולת תהיה הכניסה מעט עם לחץ עדין. עובי הגולגולת אופטימלי עבור הדמיה הוא בין 10 ל 30 מיקרומטר.
- כאשר הגולגולת הוא דק החלון לנקות את כל הפסולת, המקום מלוחים על הגולגולת. צילום חלון הדמיה עם מצלמה דיגיטלית רכוב על היקף הניתוחים. צילום ושימוש בכלי הדם במוח יסייעו באיתור המיקום למקום צלחת הדמיה עבור הפעלות הדמיה הבאים.
- התחבורה את בעל החיים מעטה 2-הפוטון. החיה צריכה להישאר על השמיכה חימום (עם בדיקה רקטלית) במהלך הפגישה הדמיה כולו. הערה: בעוד תחת סדציה, הגוף הליבה של החיה טמפרטורה ינוע מאוד בהעדר יחידת החימום וכתוצאה מכך פגיעה בקליפת המוח או אולי מוות.
- מיקרוסקופ שני הפוטונים עם המאי טאי לייזר, משאבה 10W מצב מוצק כוח מקסימלית אולימפוס שונה יחידת Fluoview confocal משמש. המערכת מותאמת במיוחד עבור הדמיה רקמות עמוק גלאי חיצוני מותקנים קרוב אובייקטיבי ככל האפשר, כדי לאפשר גילוי מרבי של הקרינה מהמוח. LUMPlan Olympus FL / IR עדשה 20X/0.95NA אובייקטיבי משמש. מלח 0.9% משמש במהלך הדמיה עבור הטבילה אובייקטיבי.
- שימוש במיקרוסקופ, עם זום דיגיטלי נמוכה (x1) לזהות אזור המכיל נוירונים שכותרתו במאור פנים.
- שימוש במצלמה דיגיטלית מודבקת פיסת עין המיקרוסקופ, לצלם באזור הדמיה. לחלופין, לשרטט את התבנית vasculature דם. זה הכרחי מחדשלהפוך את המיקום הדמיה אותו בנקודת הזמן שלאחר מכן.
- השג ערימה הגדלה נמוכה (X20 אובייקטיבי, 512x512 פיקסל; 5 צעד מיקרומטר) באמצעות במידה לעין כל של המוח (בדרך כלל פורש ~ 200 מיקרומטר) מראה את מידת הסתעפות דנדריטים. הערה: את התמונה בהגדלה נמוכה ישמש כדי לאתר את האזור הדמיה בנקודות זמן עוקבות כמו גם כלי הדם דנדריטים לשמור על המבנה שלהם בבעלי חיים צעירים למבוגרים.
- באמצעות תוכנת הדמיה (Fluoview, נ '5.0, FV300), להגדיל הגדלה דיגיטלית 8 פי. התאם את X, Y קואורדינטות (מחבת הקואורדינטות) אם יש צורך לאסוף ערימה בהגדלה גדולה אשר יראה מורפולוגיה הדנדריטים מפורט כולל את מיקומי ואת המבנה של הקוצים הדנדריטים. הערות מפורטות לגבי כל אוסף ערימה, כלומר מחבת קואורדינטות, טווח של איסוף, גודל Z-צעד את מספר הצעדים בערימה שלך. הערות אלה ישמשו כאשר חוזרים דנדריט זה או האקסון בנקודת הזמן שלאחר מכן.
- בעקבות הדמיה, הסר את צלחת הראש בעדינות על ידי הפרדת צלחת מפני השטח הגולגולת. בעזרת מלקחיים, להסיר את כל שאריות הדבק שנותרו על הגולגולת לנגב משטח הגולגולת עם תמיסת מלח סטרילית 0.9%. לתפור את העור מעל הגולגולת יחד באמצעות # 6 חוט התפירה. אזור נגב עם 70% אתנול. כדי להקל על הכאב במהלך ההתאוששות שלאחר הניתוח, לנהל 0.1 מ"ג / ק"ג כאבים עצירות, SQ.
- מקום חיות בכלוב נקי מתחת לפנס חום עד מתעורר הוא נייד. חזור החיה לכלוב המקורי.
- כדי החי Reimage בשלב מאוחר יותר (זמן שלנו הדמיה נקודות יכול להיות בכל מקום בין 2 ימים חודשים רבים בנפרד), להסיר את התפרים או לפתוח מחדש את העור על הראש באמצעות שיטות aseptic לעיל. השתמש תמונה דיגיטלית של המוח vasculature (שצולמו במועד הניתוח הראשון) כדי לאתר את המיקום הדמיה המקורי. Reaffix נירוסטה headplate (שלבים 10-12). השתמש להב microsurgical בעדינות דקה משם כל עצם שאולי מחדש גדל בין נקודות הדמיה הזמן. אם יש צורך, דק עם מקדח שיניים. הדמיה חלון שקוף של פסולת וליישם ירידה של 0.9% סליין סטרילית.
- Carry החיה מיקרוסקופ שני הפוטונים ולאתר בתחום ההדמיה המקורית. השתמש בצילום דיגיטלי נלקח במהלך הפגישה הדמיה הראשון סיוע.
- פתח את התוכנית Fluoview ולפתוח את התמונה המקורית בהגדלה נמוכה. לצרף גיליון שקיפות למסך המחשב לשרטט את כלי הדם הגדולים דפוס באמצעות עט שקיפות.
- פתח את התמונה חיה ויישר מחדש את הדם בכלי הדם לדפוס שירטט על הסרט שקיפות.
- כדי Reimage 8x zoomed במבנים, לפתוח את מחסנית שנאספו הרצוי מההפעלה הדמיה הקודם. סקיצה המבנה (axonal כלומר, דנדריטים, גליה) על סרט שקיפות, מודבקת על מסך המחשב.
- קרב 8x מהתמונה חי ולהגדיר את המחבת קואורדינטות הפרמטרים הדמיה היום הראשון. בהתאם דיוק של יישור מיקום הגדלה נמוך, ייתכן שיהיה צורך גם לשנות את הזווית של התמונה במקצת. לאחר המבנה המבוקש נמצא, להתאים את המבנה לדפוס שירטט שלך בהגדלה גבוהה. אסוף את Z-מחסנית עם גודל צעד מספר זהה של Z-מחסנית תמונות לניתוח שלאחר מכן.
- חזור על שלבים 29 ו - 30 עד שכל התמונות בהגדלה גבוהה מחדש שנאספו.
- כאשר ההדמיה תושלם, חזור על שלבים 22-24. Re-הדמיה ניתן לחזור במהירות של עד 2 נקודות זמן נפרדות.
- ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ביבר אגף לרפואה של בעלי חיים המעבדה של אוניברסיטת רוצ'סטר בית הספר לרפואה ורפואת שיניים, ב ההסמכה מלא על ידי האגודה הערכה וההסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה, הבינלאומי (AAALAC) ונמצאים ציות לחוק המדינה, החוק הפדרלי מדיניות NIH.
נציג תוצאות
ב-GFP-M עכברים להביע, קבוצת משנה של שכבה 5 תאים דנדריטים פירמידה ותהליכים המתאימים יכול בקלות להיות דמיינו באמצעות 2-פוטון סריקת לייזר מיקרוסקופית (2PLSM) 1. כאן אנו הפגינו הכנה דליל-הגולגולת שבו הגולגולת מעל המיקום הרצוי הדמיה מדולל ל ~ 10-30 מיקרומטר. בביצוע נכון, פרוטוקול שלנו אפשרה לנו בבירור לדמיין דנדריטים קליפת המוח ועמוד השדרה בקליפת המוח הראייתית שלם לניתוח אקוטית או כרונית (איור 2).
באיור 1. ראש מותאם אישית צלחת הבסיס. (א) להציג לראש בראש בהתאמה אישית ועל צלחת הבסיס המשמשים להכנת דליל, ניתוח בגולגולת. (ב) להציג צד של הראש מחוייט צלחת הבסיס. (C, D) סכמטי מפורט תמונה של צלחת ראש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה כרונית באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה הופכת פופולרית יותר ויותר טכניקה ללמוד שינויים מורפולוגיים מופעלות במהלך 2-5 הפלסטיות. כאן אנו מדגימים הכנה דליל, גולגולת לעקוב הקוצים הדנדריטים מזוהה במוח העכבר על ימים שלמים הדמיה שונים. בפרוטוקול זה, הגולגולת נותר בשלמותו, גרימת נזק מינימלי לקליפת המוח וכתוצאה מכך רמות נמוכות מאוד של neuroinflammation אשר עשוי לשנות את תפקוד המוח 6. זה מאפשר את החיה להיות צילמו מיד לאחר הניתוח הראשון ולאחר מכן reimaged ימים לאחר מכן שנים מאוחר יותר. זוהי טכניקה רבת עוצמה, אך יש גם מגבלות. הכנת חלון פולשניים יותר הכוללת craniotomy והפעלה גליה הקשורים ומכאן, מאפשרת הדמיה חוזרת של המוח עם מספר שרירותי של הפעלות הדמיה תוך גולגולתי חלון ברורה. הכנה הגולגולת דקה, לעומת זאת, מוגבלת לכל היותר שלושה מפגשים הדמיה עקב הניתוח מעורבים פתיחה וסגירה העור של העכבר. בנוסף, עומק החדירה הוא מעולה 2 בחלון גולגולתי. בחינה קפדנית ולכן צריך להילקח כאשר מחליטים בגישה כירורגית ניסויים הדמיה כרונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרס Wellcome קריירה בורוז במדעי ביו (AKM), קרן וייטהול מענק מחקר (AKM), מלגת קרן סלואן (AKM), NIH EY019277 (AKM), וכן במימון ניי, חזון הדרכה גרנט, EY013319 ( EAK).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
||
| Medetomindine Hydrochloride | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
||
| Midazolam HCL | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
||
| 2,2,2-tribrom–thanol | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1% |
|||
| 2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%) | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775% |
|||
| TC-1000 Temp. Control System for Mice | CWE, Inc. | TC-1000 Mouse | Body Temp. Regulation | |
| Toberadex | In House | Eye Ointment | ||
| 10% Ferric Chloride | Ricca Chemical Company | 3120-32 | Thin-skull preparation | |
| Microsurgical Blade | Sable Industries | S-6400 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 404,401 | Loctite | P/N 46551 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 401 | Loctite | P/N 40140 | Thin-skull preparation | |
| Zip Kicker Glue Accelerator | Pacer Technology | PT-29 | Thin-skull preparation | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | Thin-skull preparation | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Thin-skull preparation | |
| #6-0 (0.7 metric ) silk suture | Ethicon Inc. | K8894H | Taper C-1 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11000-12 |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
