Summary
我们在这个视频和补充材料，表现出对慢性协议
Abstract
在体内成像，利用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）允许在完好的大脑活体细胞和神经元突起的研究。这里介绍的技术，允许在几个时间点与微观的决议，允许这是代表多数在中枢神经系统的兴奋性突触后网站的一小结构的树突棘的跟踪（慢性成像）的大脑同一区域的成像。能够清楚地解决以上几个时间点的优良的皮质结构有很多优点，特别是在大脑的可塑性，在突触和电路重塑的形态学变化可能有助于解释底层机制的研究。在这个视频和补充材料，我们将展示一个长期在体内的完整使用一个头骨变薄，准备的脑成像协议。薄头骨准备是一种微创的方法，从而避免了潜在损害的硬脑膜和/或皮质，从而减轻炎症反应的发生。当执行这个协议是正确的，它可以清楚地监测树突棘的特点，在经过一段时间的长期完整的大脑变化。
Protocol
- 要完整的使用双光子显微镜，一个神经元与荧光标记物标记的准备的大脑中的神经元可视化使用。这里介绍在实验中，我们使用的GFP - M的转基因小鼠线，标签5层的锥体细胞。 5层的锥体细胞投射到表层的树突状进程，使树突和树突棘的可视化深度为300微米以下的PIA水平。另一种方法是使用病毒标志物（见洛厄等 。提交给朱庇特）标签细胞。
- 消毒工作区，使用70％的乙醇和高压灭菌器工具，无菌手术。支付业务用干净的敷料表面。
- 麻醉与芬太尼鸡尾酒（芬太尼0.05毫克/公斤;咪唑安定5毫克/公斤; metatomadin 0.5毫克/公斤）小鼠由Avertin季度剂量使用IACUC核准程序（0.0075毫克/毫升）。预处理小鼠的镇痛，丁丙诺啡（0.5毫克/公斤）皮下注射（SQ）。麻醉平面显示器的水平测试反应尾/脚趾捏。
- 保持动物在37.5 ° C加热毯使用带有附加直肠温度计。
- 眼药膏眼睛，防止眼睛干燥。用一张小纸罩的眼睛，保护眼睛在手术过程中光源。
- 用剪刀，去除头发从后脑勺（背后耳朵）眼睛。
- 清洁动物的连续应用70％乙醇的头顶部，其次是优碘擦洗和优碘解决方案。
- 背后的耳朵和向上的L型切割的切口，沿中线（取决于哪个半球成像）对眼睛的右边或左边。折叠皮肤远离手术的部位。不要清除皮肤成像会议将缝合皮肤。
- 用细镊子轻轻拉动皮肤，和远离你感兴趣的领域。
- 远离暴露头骨的面积用干净的镊子或显微刀片轻轻刮去骨膜。使用棉签，申请了10％三氯化铁少量颅骨骨膜膜完全干燥，并确保它已完全去除。重要的是，头骨是完全干的胶水，以确保正确的坚持（见11）。使用产钳或显微刀片轻轻刮去干骨膜膜。
- 应用周围氰基丙烯酸酯胶的一层薄薄的不锈钢封头板（见图1），并加盖颅骨外板成像窗口。
- 用棉花拭子棒木，适用于胶成像窗口内缝线;务必填写颅骨成像板和曲率之间的所有空隙。
- 将下降到窗口的胶水加速器。快速擦去多余的胶水加速器，用棉签或金擦拭。胶水应完全凝固钻前。
- 开始使用牙钻一个0.7毫米的不锈钢毛刺贴在成像窗口颅骨薄。备用钻井偶尔应用0.9％的无菌生理盐水，以避免产生过多的头骨上的热。
- 薄的整个头骨表面的牙钻使用小中风的头骨上一个4x4毫米的窗口。测试与钝端钳薄的头骨。头骨表面缩进稍微温和的压力。颅骨成像的最佳厚度为10至30微米。
- 当颅骨薄，窗口清理所有杂物，放置在头骨生理盐水。安装解剖范围的数码相机拍摄的成像窗口。脑血管摄影和使用，将有助于定位的位置放置后续成像会话成像板。
- 2光子钻机运输动物。动物应该保持在整个成像会议上加热毯（直肠探头）。注：而下的镇静，动物的核心体温会在一个加热造成皮质的损害或可能死亡的单位的情况下波动很大。
- 一个与埋汰10W的最大功率和修改后的奥林巴斯Fluoview共焦单位的固态激光器，泵的双光子显微镜使用。深部组织成像系统优化和外部探测器接近客观，尽可能地让大脑最大的荧光检测，安装。奥林巴斯LUMPlan FL / IR 20X/0.95NA物镜是用来。 0.9％生理盐水用于在客观淹没成像。
- 使用这种显微镜，低数码变焦（X1）确定一个区域，包含明亮标神经元。
- 使用数码相机，贴在显微镜目镜，成像区域的照片。另外，勾勒出血液血管格局。这是有必要重新在随后的时间点，打开相同的成像位置。
- 通过整个大脑树突分枝的程度（通常是跨越〜200微米）的可见程度，获取一个低倍率栈（X20目标，512x512像素; 5微米的一步）。注：这种低倍率的图像将被用来定位在随后的时间点成像区域的血管和树突保持其在青少年和成年动物的结构。
- 使用图像处理软件（Fluoview，诉5.0，FV300），增加8倍数字放大倍率。调整X，Y坐标（坐标平移）如果有必要，并收集了高倍率栈，它会显示详细的树突状形态，包括地点和树突棘的结构。每个堆栈收集，即泛坐标，收集，Z -步长和步骤在您的堆栈数量范围进行详细的注释。这些债券将返回这个树突或轴突在随后的时间点时使用。
- 成像后，取出轻轻分开头骨表面的板头板。使用镊子，取出头骨其余任何残胶，头骨表面，并用0.9％无菌生理盐水擦拭。在头骨一起使用＃6缝合线缝合皮肤。用70％乙醇擦拭面积。为了减轻在手术后的恢复疼痛，管理0.1毫克/公斤丁丙诺啡镇痛，SQ的。
- 将动物热灯，直到它被唤醒，是流动的，在清洁笼子。返回到原来的笼子里的动物。
- 要重新映像在稍后的时间点（我们的成像时间点，可以在任何地方从2天，除了许多个月）的动物，去除缝线，或重新使用上述无菌方法对头部皮肤。使用脑血管（第一次手术日期）的数字图像，找到原来的成像位置。 Reaffix不锈钢磁头板（步骤10-12）。使用显微刀片轻轻薄了成像时间点之间的任何可能重新种植骨。如有必要，牙钻薄。碎片的清晰成像窗口申请下降0.9％无菌生理盐水。
- 携带动物双光子显微镜，并找到原始影像领域。使用援助的第一次成像会议期间采取的数码照片。
- 打开Fluoview方案和开原的低倍率的图像。贴上投影胶片，在计算机屏幕上和草图的主要血管的模式使用的透明度钢笔。
- 打开实时图像，并重新调整血液血管的透明胶片上勾画图案。
- 为了重新映像结构中的8X放大，开辟从以前的成像会话中收集了所需的栈。画出结构（即轴突，树突，神经胶质）到一个透明的薄膜，贴在计算机屏幕上。
- 变焦8X从现场影像和设置泛坐标，第一天的成像参数。根据调整低倍率的位置的准确性，它可能是必要的，还可以调整角度的图像略有。一旦找到所需的结构，您勾勒的高放大倍率的模式匹配结构。收集相同的步骤大小和Z - Stack的图像，供后续分析，Z - Stack的。
- 重复步骤29和30，直到所有的高放大倍率的图像重新收集。
- 当成像完成后，重复步骤22-24。可反复重新成像在2个独立的时间点。
- 动物实验动植物公园和罗切斯特大学医学和牙科学院的实验室动物医学部规定的准则和法规的规定进行全面评审，由实验动物评估和认可协会，国际（AAALAC），并在遵守国家法律，联邦法律和美国国立卫生研究院政策。
代表性的成果
GFP - M的表达小鼠，第5层的锥体细胞和相应的树突状进程的一个子集可以很容易地可视化，使用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）1。在这里，我们展示了一个薄的头骨的准备，其中超过所需的成像位置的头骨变薄〜10-30微米。正确执行，我们的协议使我们清楚看到皮层的树突和完整的视觉皮层的急性或慢性的分析（图2）刺。
图1。自定义头和底板 （一）定制的头和颅骨变薄，手术前准备用于底板的顶视图。 （二）定制的头和底座的侧视图。 （C，D）头板的详细原理和形象。
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Discussion
慢性成像，利用双光子显微镜技术正成为一个日益流行的技术，研究过程中的可塑性2-5引发的形态学变化。在这里，我们展示了一个薄的头骨的准备工作，按照不同的成像天在完整的小鼠大脑中确定的树突棘。在这个协议中，头骨是原封不动的，造成最小损害的皮质和neuroinflammation非常低的水平，这可能会改变大脑功能6。这使得动物成像后，立即在第一次手术，然后随后重新制作映像天至数年以后。这是一个强大的技术，但也有其局限性。愈创窗口的准备，其中包括一个开颅手术，并因此相关的胶质激活，允许重复的一个任意数量的成像会的脑成像，而颅窗口是明确的。颅骨薄的准备，但是，由于参与开幕式和闭幕式的老鼠的皮肤手术最多三个成像会议是有限的。此外，穿透深度是优越的颅窗口2。因此，应仔细考虑决定时采取的手术方法治疗慢性成像实验。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由宝来惠康（AKM）在生物医学科学事业奖，白厅基金研究资助（AKM），斯隆基金会奖学金（AKM），美国国立卫生研究院EY019277（AKM），和聂资助，视力训练补助金，EY013319（ EAK）。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| Medetomindine Hydrochloride | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| Midazolam HCL | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| 2,2,2-tribrom–thanol | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1% |
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| 2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%) | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775% |
|||
| TC-1000 Temp. Control System for Mice | CWE, Inc. | TC-1000 Mouse | Body Temp. Regulation | |
| Toberadex | In House | Eye Ointment | ||
| 10% Ferric Chloride | Ricca Chemical Company | 3120-32 | Thin-skull preparation | |
| Microsurgical Blade | Sable Industries | S-6400 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 404,401 | Loctite | P/N 46551 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 401 | Loctite | P/N 40140 | Thin-skull preparation | |
| Zip Kicker Glue Accelerator | Pacer Technology | PT-29 | Thin-skull preparation | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | Thin-skull preparation | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Thin-skull preparation | |
| #6-0 (0.7 metric ) silk suture | Ethicon Inc. | K8894H | Taper C-1 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11000-12 |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
