Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Summary

In diesem Video-und ergänzendes Material zeigen wir ein Protokoll für die chronische

Abstract

In-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2PLSM) ermöglicht die Untersuchung von lebenden Zellen und neuronalen Prozesse im intakten Gehirn. Die hier vorgestellte Technik ermöglicht die Abbildung des gleichen Bereich des Gehirns zu verschiedenen Zeitpunkten (chronische Imaging) mit mikroskopischer Auflösung ermöglicht die Verfolgung von dendritischen Dornen, die die kleinen Strukturen, die die Mehrheit der postsynaptischen exzitatorischen Seiten im ZNS darstellen. Die Fähigkeit, klar zu lösen feinen kortikalen Strukturen über mehrere Zeitpunkte hat viele Vorteile, insbesondere bei der Untersuchung der Plastizität des Gehirns, in denen morphologische Veränderungen an den Synapsen und Schaltung Umbau erklären helfen, zugrunde liegenden Mechanismen können. In diesem Video-und Zusatzmaterial, zeigen wir ein Protokoll für chronischen in vivo-Bildgebung des intakten Gehirn mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung. Die ausgedünnten Schädel Präparat ist ein minimal-invasiven Ansatz, der mögliche Schäden an der Dura und / oder Cortex vermeidet, wodurch die Entstehung einer entzündlichen Reaktion. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, ist es möglich, deutlich Überwachung von Änderungen in dendritischen Dorn Eigenschaften im intakten Gehirn über einen längeren Zeitraum.

Protocol

1. Zur Visualisierung Neuronen im intakten Gehirn über Zwei-Photonen-Mikroskopie, ein Präparat, wo Nervenzellen mit fluoreszierenden Markern versehen werden wird. In den Experimenten stellte hier benutzen wir die GFP-M transgenen Maus Linie, die Schicht Etiketten 5 Pyramidenzellen ^1. Layer 5 Pyramidenzellen Projekt dendritischen Prozesse in oberflächlichen Schichten, so dass die Visualisierung von Dendriten und dendritischen Dornen bis zu einer Tiefe von 300 um unter dem Niveau der Pia. Ein alternativer Ansatz besteht darin, Label-Zellen unter Verwendung von viralen Markern (siehe Lowery et al., Eingereicht JOVE).
2. Sterilisieren der Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und Autoklav-Tools für die aseptische Chirurgie. Decken die Oberfläche mit klarem Dressing.
3. Anesthetize Mäuse mit einem Fentanyl-Cocktail (Fentanyl 0,05 mg / kg; Midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) um ein Viertel Dosis Avertin (0,0075 mg / ml) mit IACUC genehmigten Verfahren folgten. Vorbehandeln Mäuse mit dem Analgetikum Buprenorphin (0,5 mg / kg) subkutan (SQ) verabreicht. Überwachen Sie den Grad der Narkose Ebene, die durch Tests Reaktion auf tail / toe kneifen.
4. Behalten Tier bei 37,5 ° C mit Heizdecke mit angeschlossenem Rektalthermometer.
5. Bewerben Augensalbe die Augen, die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern. Hood Augen mit kleinen Blatt Papier die Augen von der Lichtquelle zu schützen während der Operation.
6. Mit einer Schere entfernen Haare von der Rückseite des Kopfes (hinter den Ohren) auf die Augen.
7. Reinigen Sie die Spitze der Kopf des Tieres mit sequentieller Anwendung von 70% Ethanol, gefolgt von betadine schrubben und betadine Lösung.
8. Machen Sie einen L-Schnitt Schnitt hinter den Ohren und entlang der rechten oder linken Seite der Mittellinie (je nachdem, welcher Hemisphäre abgebildet wird), um die Augen. Falten Sie die Haut über und weg von der Operation vor Ort. Entfernen Sie nicht Haut, da die Haut nach dem Imaging-Sitzung vernäht werden.
9. Mit feinen Pinzette vorsichtig die Haut nach oben und weg von Ihrem Bereich des Interesses.
10. Vorsichtig abkratzen der Knochenhaut aus dem exponierten Bereich des Schädels mit sauberen Pinzette oder mikrochirurgischen Klinge. Mit Wattestäbchen, eine kleine Menge von 10% Eisen-III-Chlorid auf den Schädel vollständig trocknen, das Periost Membran und sicherzustellen, dass sie vollständig entfernt worden ist. Es ist wichtig, dass der Schädel völlig trocken, um die ordnungsgemäße Einhaltung der Leim zu gewährleisten (siehe 11). Mit einer Pinzette oder mikrochirurgischen Klinge sanft weg kratzen getrocknet Periost Membran.
11. Tragen Sie eine dünne Schicht von Sekundenkleber um die Imaging-Fenster des Edelstahl Kopfplatte (siehe Abbildung 1) und bringt die Platte auf den Schädel.
12. Mit dem hölzernen Ende eines Baumwoll-Tupfer-Stick, Leim, um Nähte innen der Imaging-Fenster; achten Sie darauf, alle Lücken zwischen den Imaging-Plate und Krümmung des Schädels zu füllen.
13. Geben Sie einen Tropfen Leim Beschleuniger in das Fenster. Schnell abwischen überschüssigen Leim-Beschleuniger mit einem Wattestäbchen oder kim wischen. Der Kleber muss vollständig vor dem Bohren verfestigt werden.
14. Beginnen Sie den Schädel in der Imaging-Fenster mit einem zahnärztlichen Bohrer mit 0,7 mm Edelstahl Grat angebracht dünn. Alternate Bohren mit gelegentlichem Auftragen von 0,9% steriler Kochsalzlösung zu vermeiden, erzeugen zu viel Hitze auf dem Schädel.
15. Thin einem 4x4 mm Fenster auf den Schädel mit kleinen Schlägen auf den Schädel Oberfläche mit dem zahnärztlichen Bohrer. Testen Sie die Schlankheit des Schädels mit stumpfen Ende einer Pinzette. Der Schädel Oberfläche wird leicht Gedankenstrich mit sanftem Druck. Die optimale Schädel Dicke für die Bildgebung ist zwischen 10 und 30 um.
16. Wenn der Schädel dünn ist und das Fenster von allen Verunreinigungen gereinigt, statt Kochsalzlösung auf dem Schädel. Fotografieren Sie die Imaging-Fenster mit einer digitalen Kamera, montiert auf eine Binokular. Fotografie und die Nutzung des Gehirns Gefäßsystem wird bei der Ortung der Lage, die Imaging-Plate für die anschließende Bildgebung Sitzungen statt zu helfen.
17. Transport des Tieres auf die 2-Photonen-rig. Das Tier sollte auf der Heizdecke (mit rektalen Sonde) während der gesamten Imaging-Sitzung bleiben. Hinweis: Während unter Sedierung, das Tier Körperkerntemperatur wird stark schwanken in der Abwesenheit einer Heizeinheit was in kortikalen Schäden oder sogar Tod.
18. Ein Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Mai Tai Laser, ein 10W Solid-State-Pumpe für maximale Leistung und ein modifiziertes Olympus FluoView konfokalen Einheit verwendet wird. Das System ist für tiefe Tissue Imaging optimiert und externen Detektoren sind so nah an das Ziel installiert wie möglich, um eine maximale Detektion von Fluoreszenz aus dem Gehirn ermöglichen. Eine Olympus LUMPlan fl / IR 20X/0.95NA Objektiv verwendet wird. 0,9% iger Kochsalzlösung wird während der Bildgebung für die objektive Untertauchen verwendet.
19. Mit diesem Mikroskop und niedrige digitaler Zoom (x1) identifizieren eine Fläche, die hell markierten Neuronen.
20. Mit einer digitalen Kamera angebracht, um das Mikroskop-Okular, nehmen Sie ein Foto von den Imaging-Bereich. Alternativ skizzieren das Blut Gefäßsystem Muster. Dies ist notwendig, um wiederwiederum die gleichen bildgebenden Lage zu einem späteren Zeitpunkt.
21. Besorgen Sie sich ein geringer Vergrößerung Stack (x20 Ziel, 512x512 Pixel, 5 um Schritt) durch das gesamte sichtbare Ausmaß des Gehirns (in der Regel Spanning ~ 200 pm) zeigt das Ausmaß der dendritischen Verzweigung. Hinweis: Diese geringe Vergrößerung Bild wird verwendet, um den Imaging-Bereich bei späteren Zeitpunkt zu lokalisieren, da beide Blutgefäße und Dendriten ihrer Struktur in jungen und erwachsenen Tieren zu erhalten.
22. Mit Bildbearbeitungs-Software (FluoView, v. 5.0, FV300), erhöhen die digitale Vergrößerung 8-fach. Passen Sie den X-, Y-Koordinaten (pan-Koordinaten), wenn notwendig und sammeln eine hohe Vergrößerung Stapel, die detaillierte dendritische Morphologie mit den Standorten und die Struktur der dendritischen Dornen zeigen. Nehmen Sie detaillierte Hinweise jedem Stapel Sammlung, dh pan-Koordinaten, den Bereich der Sammlung, die z-Schritt-Größe und die Anzahl der Schritte in Ihrem Stack. Diese Notizen werden genommen, wenn sie auf diese Dendriten oder Axonen zu einem späteren Zeitpunkt sein.
23. Nach Bildgebung, entfernen Sie die Kopfplatte durch vorsichtiges Trennplatte aus Kopfoberfläche. Mit einer Pinzette entfernen Sie alle Klebereste übrigen am Schädel und wischen Kopfoberfläche mit 0,9% steriler Kochsalzlösung. Suture die Haut über den Schädel zusammen mit Nr. 6 Nähfaden. Wischen Sie mit 70% Ethanol. Um Schmerzen zu lindern während der postoperativen Erholung, verwalten 0,1 mg / kg Buprenorphin analgetisch, SQ.
24. Tier in den Käfig sauber unter einer Wärmelampe, bis sie aufwacht und ist mobil. Zurück Tier ursprünglichen Käfig.
25. Um reimage Tier zu einem späteren Zeitpunkt (unsere Imaging Zeitpunkten kann irgendwo zwischen 2 Tagen und mehreren Monaten auseinander), zu entfernen Stiche oder öffnen Sie die Haut an Kopf mit aseptischen Verfahren wie oben. Verwenden Sie das digitale Bild des Gehirns Gefäßsystem (aufgenommen bei der ersten OP-Termin), um den ursprünglichen Imaging-Standort zu lokalisieren. Wiederanzubringen Edelstahl Kopfplatte (Schritte 10-12). Verwenden Sie einen mikrochirurgischen Klinge sanft dünne entfernt alle Knochen, der möglicherweise zwischen Bildgebung Zeitpunkten wieder gewachsen sind. Wenn nötig, dünn mit Dentalbohrers. Klare Imaging-Fenster von Schmutz und einen Tropfen 0,9% steriler Kochsalzlösung.
26. Carry Tier zu Zwei-Photonen-Mikroskop und suchen ursprünglichen Imaging-Bereich. Verwenden Sie die digitale Fotografie im ersten abbildenden Sitzung um Hilfe genommen.
27. Öffnen Sie die FluoView Programm und öffnen Sie die ursprüngliche geringer Vergrößerung Bild. Bringen Sie eine Transparenz Blatt auf dem Computer-Bildschirm und skizzieren die wichtigsten Blutgefäße Muster mit einer Transparenz Stift.
28. Öffnen Sie das Live-Bild und richten Sie die Blut-Gefäßsystem an die skizzierten Muster auf der Folie aus.
29. Um reimage die 8x in Strukturen vergrößert haben, öffnen Sie die gewünschte gesammelten Stapel aus der vorherigen Abbildung Sitzung. Skizzieren Sie die Struktur (dh axonale, dendritische, Gliazellen) auf eine transparente Folie, angebracht auf den Bildschirm.
30. Zoom in 8x aus dem Live-Bild und stellen Sie die Pfanne Koordinaten auf den ersten Tag Aufnahmeparameter. Je nach Genauigkeit der Ausrichtung der geringer Vergrößerung Lage, kann es notwendig sein, um auch den Winkel des Bildes leicht. Sobald die gewünschte Struktur gefunden wird, passen die Struktur Ihrer skizziert hoher Vergrößerung Muster. Sammeln Sie die z-Stapel mit den gleichen Schritt Größe und Anzahl der Z-Stapel-Bildern für die spätere Analyse.
31. Wiederholen Sie die Schritte 29 und 30, bis alle die hohe Vergrößerung Bilder wieder abgeholt werden.
32. Bei der Abbildung abgeschlossen ist, wiederholen Sie die Schritte 22-24. Re-imaging kann wiederholt werden, bis zu 2 separate Zeitpunkten.
33. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Vivarium und Division of Laboratory Animal Medicine der University of Rochester School of Medicine and Dentistry Satz durchgeführt, in voller Akkreditierung durch die Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALAC) und sind in Übereinstimmung mit den staatlichen Gesetzen, Bundesgesetz und NIH-Politik.

Repräsentative Ergebnisse

In GFP-M zum Ausdruck Mäuse, kann eine Teilmenge der Schicht 5 Pyramidenzellen und der entsprechenden dendritischen Prozesse einfach visualisieren mittels 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2PLSM) ^1. Hier zeigte eine ausgedünnte Schädel Vorbereitung, in der die Schädel über die gewünschte Bildgebung Lage auf ~ 10-30 um ausgedünnt ist. Korrekt ausgeführt, erlaubt unser Protokoll uns klar zu visualisieren kortikalen Dendriten und Dornen in der intakten visuellen Kortex für akute oder chronische Analyse (Abbildung 2).

Abbildung 1. Benutzerdefinierte Kopf-und Bodenplatte. (A) Draufsicht custom made ​​Kopf und Grundplatte für ausgedünnte Schädel-Operation der Herstellung verwendet. (B) Seitenansicht von maßgeschneiderten Kopf-und Bodenplatte. (C, D) Detaillierte schematische und das Image der Kopfplatte.

in vivo in der Sehrinde einer transgenen GFP-M-Maus mit zwei-Photonen-Mikroskopie abgebildet. Das Bild ist eine Projektion des einzelnen Bildes erhalten alle 5 um von der pia eine Endteufe von 175 um. Die boxed-Bereich in A repräsentiert den vergrößerten Bereich in (B) und (C) am Tag abgebildet 0 (D0) und vier Tage später (D4). (D, E) Höhere Vergrößerung von dendritischen Zweig boxed in B und C zeigen stabile Stacheln (weißer Pfeil Köpfe), verloren / Zurückziehen Stacheln (rote Pfeilspitzen) und neue Stacheln (grüne Pfeilspitzen). Maßstabsbalken = A. 200 um, B, C. 20 mu m, D, E. 5 um.

Discussion

Chronische Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein zunehmend beliebtes Verfahren, um morphologische Veränderungen während der Plastizität ^2-5 ausgelöst studieren. Hier zeigen wir eine ausgedünnte Schädel Vorbereitung auf die identifizierten dendritischen Dornen im intakten Gehirn der Maus auf verschiedenen bildgebenden Tagen folgen. In diesem Protokoll wird der Schädel intakt gelassen, wodurch minimale Schäden an der Rinde und was zu einem sehr niedrigen Niveau von Neuroinflammation die Funktion des Gehirns zu verändern ^6. Mai. Dies ermöglicht das Tier unmittelbar nach der ersten Operation und anschließend reimaged Tage bis Jahre später abgebildet werden. Dies ist eine mächtige Technik, sondern hat auch seine Grenzen. Je mehr invasive Fenster Zubereitung, die eine Kraniotomie und damit verbundenen Gliazellen Aktivierung erfolgt, ermöglicht wiederholen Bildgebung des Gehirns mit einer beliebigen Anzahl von Imaging-Sitzungen während der Schädelbasis Fenster ist klar. Die dünne Schädeldecke Vorbereitung, ist jedoch auf höchstens drei Imaging-Sitzungen durch die Operation beim Öffnen und Schließen der Maus die Haut beteiligt begrenzt. Darüber hinaus ist Eindringtiefe überlegen in der Schädelbasis Fenster ^2. Besondere Beachtung sollte daher bei der Entscheidung der chirurgischen Ansatz für chronische Imaging Experimente sein.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Medetomindine Hydrochloride		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Midazolam HCL		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribrom–thanol				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 Temp. Control System for Mice		CWE, Inc.	TC-1000 Mouse	Body Temp. Regulation
Toberadex		In House		Eye Ointment
10% Ferric Chloride		Ricca Chemical Company	3120-32	Thin-skull preparation
Microsurgical Blade		Sable Industries	S-6400	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 404,401		Loctite	P/N 46551	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 401		Loctite	P/N 40140	Thin-skull preparation
Zip Kicker Glue Accelerator		Pacer Technology	PT-29	Thin-skull preparation
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter		Fine Science Tools	19008-07	Thin-skull preparation
Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece		Ram Products, Inc.	TECH2000ON/OFF	Thin-skull preparation
#6-0 (0.7 metric ) silk suture		Ethicon Inc.	K8894H	Taper C-1
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved	Surgical Tools	Fine Science Tools	11152-10
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm	Surgical Tools	Fine Science Tools	14084-08
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	Surgical Tools	Fine Science Tools	11000-12