Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

Summary

In questo materiale video e supplementare, mostriamo un protocollo per la cronica

Abstract

Imaging in vivo con due fotoni microscopia a scansione laser (2PLSM) permette lo studio delle cellule viventi e dei processi neuronali nel cervello intatto. La tecnica qui presentata permette l'imaging della stessa area del cervello, in momenti diversi (cronica imaging) con risoluzione microscopica che permette il tracciamento delle spine dendritiche, che sono le strutture di piccole dimensioni che rappresentano la maggioranza dei siti post-sinaptici eccitatori nel SNC. La capacità di risolvere in modo chiaro multa strutture corticali sui punti più volte ha molti vantaggi, in particolare nello studio della plasticità del cervello in cui i cambiamenti morfologici a sinapsi e rimodellamento del circuito può contribuire a spiegare i meccanismi sottostanti. In questo materiale video e complementari, mostriamo un protocollo per la cronica imaging in vivo del cervello intatto con un assottigliato-teschio di preparazione. Il diradamento-cranio preparazione è un approccio mini-invasivo che evita potenziali danni per la durata e / o corteccia, riducendo così l'insorgenza di una risposta infiammatoria. Quando questo protocollo è eseguita correttamente, è possibile monitorare in modo chiaro i cambiamenti nelle caratteristiche spine dendritiche nel cervello intatto per un periodo prolungato di tempo.

Protocol

1. Per visualizzare i neuroni nel cervello intatto utilizzando la microscopia a due fotoni, una preparazione in cui i neuroni sono etichettati con marcatori fluorescenti viene utilizzato. Negli esperimenti qui presentati usiamo la GFP-M linea di topi transgenici che le etichette strato di 5 cellule piramidali ^1. Layer 5 cellule piramidali progetto processi dendritiche in strati superficiali, permettendo la visualizzazione dei dendriti e spine dendritiche fino ad una profondità di 300 micron al di sotto del livello della pia. Un approccio alternativo è quello di cellule etichetta utilizzando marcatori virali (vedi Lowery et al. Sottoposti a Giove).
2. Sterilizzare l'area di lavoro utilizzando etanolo al 70% e gli strumenti in autoclave per la chirurgia asettica. Coprire le superficie con medicazione pulita.
3. Anestetizzare topi con un cocktail di fentanyl (fentanil 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) seguita da una dose quarto di Avertin (0,0075 mg / ml) utilizzando IACUC procedure approvate. Pretrattare i topi con l'analgesico, buprenorfina (0,5 mg / kg) somministrato per via sottocutanea (SQ). Monitorare il livello del piano anestetico per reazione test di coda / tep pizzico.
4. Mantenere animale a 37,5 ° C con coperta termica con annesso termometro rettale.
5. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi per evitare che gli occhi si secchi. Cappuccio con gli occhi piccolo foglio di carta per proteggere gli occhi dalla fonte di luce durante l'intervento.
6. Utilizzando le forbici, eliminare i peli dalla parte posteriore della testa (dietro le orecchie) per gli occhi.
7. Pulire la parte superiore della testa dell'animale con l'applicazione sequenziale del 70% di etanolo, seguito da macchia betadine e Betadine soluzione.
8. Fare un L-cut incisione dietro le orecchie e lungo sia il lato destro o sinistro della linea mediana (a seconda di quale emisfero sarà ripreso) per gli occhi. Piegare la pelle sopra e lontano dal sito chirurgico. Non rimuovere la pelle come la pelle sarà suturato dopo la sessione di imaging.
9. Utilizzando una pinza sottile estrarre delicatamente la pelle in alto e lontano dalla propria area di interesse.
10. Raschiare delicatamente via il periostio dalla zona esposta del cranio con una pinza pulita o lama microchirurgica. Utilizzando tampone di cotone, applicare una piccola quantità del 10% di cloruro ferrico al cranio per asciugare completamente la membrana periostio e assicurarsi che sia stato completamente rimosso. E 'importante che il teschio sia completamente asciutta per garantire la corretta adesione del collante (vedi 11). Uso di pinze o lama di microchirurgia, raschiare delicatamente via periostio membrana secca.
11. Applicare uno strato sottile di collante cianoacrilato attorno alla finestra di imaging della piastra in acciaio inox testa (vedi Figura 1) e apporre la targa al cranio.
12. Utilizzando la fine di legno di un bastoncino di cotone-tampone, applicare la colla per le cuciture all'interno della finestra di imaging, avendo cura di riempire tutti gli spazi vuoti tra la piastra di imaging e la curvatura del cranio.
13. Mettere una goccia di colla acceleratore nella finestra. Rapidamente togliere acceleratore colla in eccesso con un batuffolo di cotone o di kim pulire. La colla deve essere completamente solidificato prima foratura.
14. Inizia a fluidificare il cranio nella finestra immagine che utilizzano un trapano dentistico munito di un 0,7 millimetri in acciaio inox bava. Foratura si alternano con l'applicazione occasionale dello 0,9% soluzione salina sterile per evitare di generare troppo calore sul cranio.
15. Sottile una finestra 4x4 mm sul cranio con piccoli colpi su tutta la superficie del cranio con il trapano odontoiatrico. Provare la magrezza del cranio con una pinza punta smussata. La superficie del cranio trattino leggermente con una leggera pressione. Lo spessore cranio ottimale per l'imaging è compresa tra 10 e 30 micron.
16. Quando il cranio è sottile e la finestra pulita di tutti i detriti, luogo salina sul cranio. Fotografare la finestra di imaging con una fotocamera digitale montata su un campo di applicazione dissezione. La fotografia e l'uso del sistema vascolare cerebrale aiuterà a localizzare la posizione per posizionare il piatto di imaging per le sessioni di imaging successive.
17. Trasporto l'animale al 2-fotone rig. L'animale deve rimanere sulla coperta di riscaldamento (con sonda rettale) durante l'intera sessione di imaging. Nota: mentre sotto sedazione, dell'animale temperatura corporea sarà soggetto a forti fluttuazioni in assenza di una unità di riscaldamento con conseguente danno corticale o forse la morte.
18. Un microscopio a due fotoni con un laser Mai Tai, una pompa da 10 W a stato solido per la massima potenza e una modificata Olympus Fluoview unità confocale viene utilizzato. Il sistema è ottimizzato per l'imaging dei tessuti profondi e rilevatori esterni sono installati il ​​più vicino all'obiettivo possibile per consentire il rilevamento massimo di fluorescenza dal cervello. Un Olympus LUMPlan fl / IR lente dell'obiettivo 20X/0.95NA viene utilizzato. 0,9% soluzione salina viene utilizzato durante l'imaging per immersione obiettivo.
19. Utilizzando questo microscopio, e bassa zoom digitale (x1) identificano un'area contenente i neuroni vivaci etichettati.
20. Utilizzando una fotocamera digitale apposta sul oculare microscopio, scatta una fotografia della zona di imaging. In alternativa, delineare il modello di vasi sanguigni. Ciò è necessario per rivolta la posizione di imaging stesso tempo in un punto successivo.
21. Ottenere una pila a basso ingrandimento (obiettivo x20, 512x512 pixel, 5 passo micron) attraverso l'intera estensione visibile del cervello (di solito si estende ~ 200 micron) che mostra l'entità della ramificazione dendritica. Nota: questa immagine bassi ingrandimenti saranno utilizzati per individuare l'area di esposizione in momenti successivi sia come vasi sanguigni e dendriti mantengono la loro struttura in animali giovani e adulti.
22. Utilizzando software di imaging (Fluoview, v. 5.0, FV300), aumentare l'ingrandimento digitale di 8 volte. Regolare l'coordinate X, Y (pan coordinate), se necessario, e raccogliere una pila alta ingrandimento che mostrerà dettagliata morfologia dendritica compresi i luoghi e la struttura delle spine dendritiche. Prendere appunti dettagliate su ogni raccolta di stack, cioè pan coordinate, la gamma della collezione, il z-passo le dimensioni e il numero di passaggi nel vostro stack. Tali schede saranno utilizzate quando tornare in questo dendrite o assone in un punto temporale successivo.
23. A seguito di imaging, rimuovere la piastra di testa con delicatezza separando placca dalla superficie del cranio. Utilizzando pinze, rimuovere eventuali residui di colla rimanente sul cranio e pulire superficie cranio con soluzione salina sterile allo 0,9%. Sutura la pelle sopra il cranio insieme usando # 6 filo di sutura. Pulire area con etanolo al 70%. Per alleviare il dolore durante il recupero post-operatorio, somministrare 0,1 mg / kg analgesico buprenorfina, SQ.
24. Luogo animale in gabbia pulita sotto una lampada di calore fino a quando non si sveglia ed è mobile. Ritorna animale alla gabbia originale.
25. Per animali re-imaging in un punto secondo momento (i nostri punti di imaging in tempo può essere ovunque da 2 giorni a molti mesi di distanza), rimuovere punti di sutura o riaprire la pelle sulla testa utilizzando metodi asettica come sopra. Utilizzare l'immagine digitale del sistema vascolare cerebrale (preso in data primo intervento) per individuare la posizione originale delle immagini. Riapporre acciaio inox headplate (punti 10-12). Utilizzare una lama sottile delicatamente microchirurgico per via qualsiasi osso che potrebbe avere nuovamente cresciuto tra i punti di tempo di imaging. Se necessario, diluire con trapano dentistico. Finestra trasparente immagini di detriti e applicare una goccia di soluzione salina sterile allo 0,9%.
26. Trasportare animali a microscopio a due fotoni e individuare campo originale di imaging. Utilizza la fotografia digitali scattate durante la sessione di imaging prima assistenza.
27. Aprire il programma Fluoview e aprire l'immagine originale basso ingrandimento. Apporre un foglio trasparente allo schermo del computer e disegnare il principale modello di vaso sanguigno con una penna trasparenza.
28. Aprite l'immagine dal vivo e riallineare il sistema vascolare sanguigno al modello delineato sulla pellicola trasparente.
29. Per il re-imaging 8x zoom in strutture, aprire lo stack desiderato raccolti dalla sessione di imaging precedente. Disegnare la struttura (cioè assonale, dendritiche, gliali) su pellicola trasparente, apposto allo schermo del computer.
30. Zoom 8x dalle immagini live e impostare il pan coordinate per i primi parametri di imaging giorno. A seconda della precisione di allineare la posizione a basso ingrandimento, può essere necessario regolare anche l'angolo delle immagini leggermente. Una volta che la struttura desiderata viene trovato, all'altezza della struttura al modello delineato alto ingrandimento. Raccogliere lo z-stack con il passo identico e il numero di Z-Stack immagini per successive analisi.
31. Ripetere i passaggi 29 e 30 fino a quando tutte le immagini ad alto ingrandimento sono ri-raccolta.
32. Quando l'imaging è completa, ripetere i passaggi 22-24. Re-imaging può essere ripetuta fino a 2 punti di tempo separati.
33. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Vivarium e Divisione di Medicina degli animali da laboratorio della University of Rochester School of Medicine and Dentistry, nel pieno riconoscimento da parte dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio, International (AAALAC) e sono in conformità con legge statale, statuto federale e la politica NIH.

Rappresentante Risultati

In GFP-M topi che esprimono, un sottoinsieme di strato di 5 cellule piramidali e corrispondenti processi dendritiche possono essere facilmente visualizzati utilizzando 2-fotone microscopia a scansione laser (2PLSM) ^1. Qui abbiamo dimostrato un assottigliato-teschio di preparazione in cui è assottigliato il cranio sulla posizione desiderata per l'imaging ~ 10-30 micron. Eseguita correttamente, il nostro protocollo ci ha permesso di visualizzare chiaramente dendriti corticale e spine nella corteccia visiva intatta per l'analisi acuta o cronica (Figura 2).

Figura 1. Testa su ordinazione e la piastra di base. (A) Vista dall'alto della testa fatta su misura e la piastra di base utilizzato per la preparazione diluito cranio-chirurgia. (B) Vista laterale della misura della testa e piastra di base. (C, D) schema dettagliato e l'immagine della piastra di testa.

in vivo nella corteccia visiva di un transgenici GFP-M mouse usando la microscopia a due fotoni. L'immagine è una proiezione della singola immagine ottenuti ogni 5 micron dal pia ad una profondità finale di 175 micron. L'area in scatola in A rappresenta l'area ingrandita in (B) e (C), ripreso il giorno 0 (D0) e quattro giorni più tardi (D4). (D, E) ingrandimento superiore della filiale dendritiche scatola in B e C dimostrando spine stabile (teste di freccia bianca), persi / spine scomparsa (teste di freccia rossa) e nuove spine (teste di freccia verde). Barre di scala = A. 200 micron, B, C. 20 micron, D, E. 5 micron.

Discussion

Immagini cronico usando la microscopia a due fotoni sta diventando una tecnica sempre più popolare per studiare i cambiamenti morfologici sono innescate durante ^2-5 plasticità. Qui dimostrare un assottigliato-teschio preparazione da seguire identificato spine dendritiche nel cervello di topo intatto nei giorni di imaging diverse. In questo protocollo, il cranio è lasciato intatto, causando danni minimi alla corteccia e conseguente livelli molto bassi di neuroinfiammazione che possono alterare la funzione del cervello ^6. Ciò permette all'animale di essere ripreso subito dopo l'intervento chirurgico e poi successivamente re-imaging giorni agli anni successivi. Questa è una tecnica potente, ma anche ha i suoi limiti. La preparazione finestra più invasiva che comporta una craniotomia e quindi associati attivazione gliale, permette di ripetere l'imaging del cervello con un numero arbitrario di sessioni di imaging mentre la finestra del cranio è chiaro. La preparazione cranio sottile, tuttavia, è limitata a un massimo di tre sessioni di imaging a causa della chirurgia coinvolti in apertura e chiusura della pelle del topo. Inoltre, la profondità di penetrazione è superiore al ² Finestra cranica. Attenta considerazione deve quindi essere presa al momento di decidere l'approccio chirurgico per esperimenti di imaging cronica.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Medetomindine Hydrochloride		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Midazolam HCL		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribrom–thanol				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 Temp. Control System for Mice		CWE, Inc.	TC-1000 Mouse	Body Temp. Regulation
Toberadex		In House		Eye Ointment
10% Ferric Chloride		Ricca Chemical Company	3120-32	Thin-skull preparation
Microsurgical Blade		Sable Industries	S-6400	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 404,401		Loctite	P/N 46551	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 401		Loctite	P/N 40140	Thin-skull preparation
Zip Kicker Glue Accelerator		Pacer Technology	PT-29	Thin-skull preparation
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter		Fine Science Tools	19008-07	Thin-skull preparation
Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece		Ram Products, Inc.	TECH2000ON/OFF	Thin-skull preparation
#6-0 (0.7 metric ) silk suture		Ethicon Inc.	K8894H	Taper C-1
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved	Surgical Tools	Fine Science Tools	11152-10
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm	Surgical Tools	Fine Science Tools	14084-08
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	Surgical Tools	Fine Science Tools	11000-12