Kronisk Imaging av Mouse syncentrum Använda en uttunnade skallen Förberedelser

Summary

I den här videon och kompletterande material, visar vi ett protokoll för kronisk

Abstract

In vivo-avbildning med två-photon mikroskopi laserskanning (2PLSM) möjliggör studier av levande celler och neuronala processer i den intakta hjärnan. Tekniken som presenteras här tillåter avbildning av samma område i hjärnan vid flera olika tidpunkter (kronisk imaging) med mikroskopiska upplösning möjliggör spårning av Dendritutskotten som är de små strukturer som representerar majoriteten av postsynaptiska excitatoriska platser i CNS. Förmågan att tydligt lösa fina kortikala strukturer under flera tidpunkter har många fördelar, speciellt i studiet av hjärnans plasticitet i vilka morfologiska förändringar i synapser och krets remodeling kan hjälpa till att förklara bakomliggande mekanismer. I denna video och kompletterande material, visar vi ett protokoll för kronisk in vivo avbildning av den intakta hjärnan med en förtunnad-skalle beredning. Den tunnas-skalle preparat är en minimalinvasiv metod, som undviker potentiella skador på duran och / eller cortex, vilket minskar uppkomsten av en inflammatorisk reaktion. När protokollet utförs korrekt är det möjligt att klart övervaka förändringar i dendritiska ryggraden egenskaper i den intakta hjärnan under en längre tid.

Protocol

1. För att visualisera nervceller i den intakta hjärnan med två-photon mikroskopi, ett preparat där nervceller är märkta med fluorescerande markörer används. I försöken presenteras här använder vi GFP-M transgen mus linje som etiketter lagret 5 pyramidala celler ^1. Lager 5 pyramidala celler projektet dendritiska processer i ytliga lager, vilket gör att visualisering av dendriter och Dendritutskotten upp till ett djup av 300 um under nivån för PIA. En alternativ metod är att märka celler med virusmarkörer (se Lowery et al. Överlämnades till JUPITER).
2. Sterilisera arbetsminne med 70% etanol och verktyg autoklav aseptisk operation. Täck drift ytan med rent förband.
3. Bedöva möss med en Fentanyl cocktail (fentanyl 0,05 mg / kg, midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) följt med en kvarts dos Avertin (0,0075 mg / ml) med IACUC godkända förfaranden. Förbehandla möss med smärtstillande, buprenorfin (0,5 mg / kg) ges subkutant (SQ). Övervaka graden av narkos plan genom att testa reaktionen på svansen / tå nypa.
4. Bevara djurens vid 37,5 ° C med värme filt med bifogade rektal termometer.
5. Applicera oftalmologiska salva till ögonen för att förhindra att ögonen torkar ut. Hood ögon med små blad för att skydda ögonen från ljuskällan under operation.
6. Använda sax, ta bort hår från baksidan av huvudet (bakom öronen) för ögonen.
7. Rengör toppen av djurets huvud med sekventiell tillämpning av 70% etanol, följt av Betadine skrubba och Betadine lösning.
8. Gör ett L-klipp snitt bakom öronen och upp längs antingen höger eller vänster sida av mittlinjen (beroende på vilken halvklotet kommer att avbildas) för ögonen. Vik huden över och bort från operation webbplats. Ta inte bort huden som huden kommer att sys efter avbildning session.
9. Använda fin pincett försiktigt dra huden uppåt och bort från ditt intresseområde.
10. Försiktigt skrapa bort periostet från exponerade området i skallen med ren pincett eller mikrokirurgisk blad. Använda bomullspinne, applicera en liten mängd av 10% järnkloridlösning till skallen för att helt torr periostet membranet och se till att den har tagits bort helt. Det är viktigt att kraniet är helt torr för att säkerställa korrekt vidhäftning av limmet (se 11). Använd pincett eller mikrokirurgisk blad, försiktigt skrapa bort torkade periostet membran.
11. Applicera ett tunt lager av cyanoakrylat lim kring avbildning fönstret i rostfritt stål huvudet plåt (se figur 1) och fästa plattan i skallen.
12. Med hjälp av trä slutet av en bomull-tops stick, gäller lim till insidan sömmar i bildbehandling fönstret, var noga med att fylla alla luckor mellan avbildning plattan och krökning av skallen.
13. Sätt en droppe lim gaspedalen i fönstret. Snabbt torka bort överflödigt lim accelerator med en bomullspinne eller Kim torka. Limmet ska vara helt stelnad före sådd.
14. Börja att tunna skallen i avbildning fönstret med hjälp av en Tandläkarborrmaskiner försedda med en 0,7 mm rostfritt stål Burr. Alternate borrning med enstaka tillämpning av 0,9% steril koksaltlösning för att undvika att skapa för mycket värme på skallen.
15. Tunna en 4x4 mm fönster på skallen med små streck över hela skallen ytan med Tandläkarborrmaskiner. Testa tunnhet i skallen med trubbiga änden pincett. Skallen ytan strecksatsen något med lätt tryck. Den optimala skallen tjocklek för bildbehandling är mellan 10 och 30 ìm.
16. När skallen är tunn och fönstret rengöras från all smuts, placera saltlösning på skallen. Fotografera avbildning fönstret med en digital kamera monterad på en dissekera omfattning. Fotografering och användning av hjärnan kärlsystemet kommer att hjälpa att hitta den position att placera imaging plattan för efterföljande avbildning sessioner.
17. Transport djuret till 2-fotonen rigg. Djuret bör vara på värme filt (med rektalsond) under hela avbildning sessionen. Obs: medan under sedering, kommer djurets kroppstemperaturen variera kraftigt i avsaknad av ett värmeelement resulterar i kortikala skador eller eventuellt dödsfall.
18. En två-photon mikroskop med en Mai Tai laser, en 10W solid state pump för maximal effekt och en modifierad Olympus Fluoview konfokala enheten används. Systemet är optimerat för djup vävnad avbildning och externa detektorer installeras så nära målet som möjligt för att möjliggöra maximal detektering av fluorescens från hjärnan. En Olympus LUMPlan fl / IR 20X/0.95NA objektivet används. 0,9% saltlösning används vid avbildning av objektiva nedsänkning.
19. Med hjälp av denna mikroskop, och låg digital zoom (x1) identifiera ett område som innehåller starkt märkta nervceller.
20. Använda en digitalkamera som fästs på mikroskop ögat bit, ta ett fotografi av imaging-området. Alternativt skissa mönstret blodet kärlbädden. Det är nödvändigt att återvända sig till samma avbildning plats vid en senare tidpunkt.
21. Skaffa en låg förstoring stack (x20 objektiv, 512x512 pixlar, 5 ìm steg) genom hela synliga omfattningen av hjärnan (vanligtvis sträcker ~ 200 mikrometer) som visar omfattningen av dendritiska förgrening. Obs: denna låga förstoringen bild kommer att användas för att lokalisera bildhantering området vid påföljande tidpunkter som både blodkärl och dendriter bibehålla sin struktur i unga och vuxna djur.
22. Använda bildhanteringsprogram (Fluoview, v. 5.0, FV300), öka digital förstoring 8-faldig. Justera X, Y-koordinater (PAN koordinater) om det behövs och samla en hög förstoring skorsten som kommer att visa detaljerad dendritiska morfologi, inklusive de platser och struktur Dendritutskotten. Ta detaljerade anteckningar om varje stapel samling, dvs panorera koordinater, utbudet av insamling, z-steg storlek och antalet steg i din stack. Dessa anteckningar kommer att användas när de återvänder till denna Dendrite eller axon vid ett senare tidpunkt.
23. Efter bildbehandling, ta bort huvudet plattan genom att försiktigt separera tallrik från skallen yta. Använd pincett, ta bort eventuella lim kvar på skallen och torka skallen ytan med 0,9% steril koksaltlösning. Sutur huden över skallen tillsammans med # 6 suturering tråd. Torka området med 70% etanol. För att lindra smärta vid postoperativ återhämtning, administrera 0,1 mg / kg buprenorfin smärtstillande, SQ.
24. Placera djur i ren bur under en värmelampa tills den vaknar upp och är mobil. Återgå djur till ursprungliga bur.
25. Att Reimage djur vid en senare tidpunkt (vår avbildning tidpunkter kan vara allt från 2 dagar till flera månaders mellanrum), ta bort stygn eller öppna huden på huvudet med hjälp av aseptisk metoder som ovan. Använd digital bild av hjärnans kärl (tas på första operation datum) för att lokalisera den ursprungliga avbildning platsen. Åter anbringa rostfritt stål headplate (steg 10-12). Använd en mikrokirurgisk blad för att försiktigt tunna bort alla ben som kan ha åter ökat mellan avbildning tidpunkter. Om det behövs, tunna med dentala borr. Tydliga avbildning fönster av skräp och tillämpa en droppe 0,9% steril koksaltlösning.
26. Bär djur till två-photon mikroskop och lokalisera original bildbehandling fältet. Använd det digitala fotografiet tas under första imaging session för hjälp.
27. Öppna Fluoview programmet och öppna den ursprungliga låga förstoringen bild. Fäst en öppenhet blad till datorskärmen och skissa de stora blodkärl mönster med hjälp av en öppenhet penna.
28. Öppna den aktiva bilden och justera blodet kärlsystemet till skisserade mönstret på OH-film.
29. För att Reimage den 8x inzoomade strukturer, öppna upp den önskade samlats stacken från föregående avbildning session. Skissa strukturen (dvs. axonal, dendritiska, gliaceller) på en OH-film, som fästs på datorskärmen.
30. Zooma in 8x från Live Image och ställ kastrullen koordinaterna till den första parametrarna dagen avbildning. Beroende på riktigheten av att anpassa den låga förstoringen plats, kan det vara nödvändigt att även justera vinkeln på bilden något. När önskad struktur hittas, matcha upp strukturen på ditt skissat hög förstoring mönster. Samla z-stack med identiska steg storlek och antal z-stack bilder för senare analys.
31. Upprepa steg 29 och 30 tills alla hög förstoring bilder samlas in.
32. När bildbehandling är klar, upprepa steg 22-24. Re-imaging kan upprepas i upp till två separata tidpunkter.
33. Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges i Vivarium och avdelningen för försöksdjursvetenskap medicin vid University of Rochester School of Medicine och tandvård, i full ackreditering av Föreningen för bedömning och ackreditering av försöksdjursvetenskap Care, International (AAALAC) och är i överensstämmelse med nationell lag, federal författning och NIH politik.

Representativa resultat

I GFP-M uttrycka möss, kan en delmängd av lager 5 pyramidala celler och motsvarande dendritiska processer enkelt visualiseras med 2-foton mikroskopi laserskanning (2PLSM) ^1. Här har vi visat en tunnas-skalle förberedelser där skallen över önskad avbildning platsen tunnas till ~ 10-30 ìm. Utförs korrekt, får våra protokoll för oss att tydligt visualisera kortikala dendriter och taggar i det intakta syncentrum för akut eller kronisk analys (figur 2).

Figur 1. Anpassad huvudet och bottenplattan. (A) Top bild av kundanpassade huvud och bottenplatta används för förtunnas-skallen kirurgi beredning. (B) Sidovy av skräddarsydda huvudet och bottenplattan. (C, D) Detaljerad schematisk och bild i huvudet plattan.

in vivo i syncentrum en transgen GFP-M mus med två-photon mikroskopi. Bilden är en projektion av enda bild vart 5 ìm från Pia till en slutlig djup av 175 ìm. Den förpackade område i en representerar den förstorade regionen (B) och (C) avbildas på dag 0 (D0) och fyra dagar senare (D4). (D, E) Högre förstoring av dendritiska gren förpackade i B och C visar stabila ryggrader (vita pilar), förlorade / återgång taggar (röda pilar) och nya taggar (gröna pilar). Skala staplar = A. 200 ìm, B, C. 20 m, D, E. 5 ìm.

Discussion

Kronisk avbildning med två-photon mikroskopi blir en allt populärare metod för att studera morfologiska förändringar utlöses under plasticitet ^2-5. Här visar vi ett förtunnas-skalle förberedelse till identifierade Dendritutskotten i den intakta musen hjärnan på olika imaging dagar. I detta protokoll, skall skallen lämnas intakt, vilket orsakar minimal skada på hjärnbarken och resulterar i mycket låga halter av neuroinflammation som kan förändra hjärnans funktion ^6. Detta gör att djur som skall avbildas direkt efter den första operationen och sedan därefter reimaged dagar år senare. Detta är en kraftfull teknik men har också sina begränsningar. Ju mer invasiv fönster preparat som innebär en kraniotomi och därmed tillhörande gliaceller aktivering, kan upprepa avbildning av hjärnan med ett godtyckligt antal bildhantering sessioner medan kraniala fönstret är tydlig. Den tunna skallen förberedelser är dock begränsad till högst tre bildbehandling sessioner på grund av operationen involverade i att öppna och stänga musens hud. Dessutom är djup penetration överlägsen i kraniella fönster ^2. Noggrant övervägande bör därför tas vid beslut om kirurgisk metod för kronisk avbildning experiment.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Medetomindine Hydrochloride		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Midazolam HCL		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribrom–thanol				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 Temp. Control System for Mice		CWE, Inc.	TC-1000 Mouse	Body Temp. Regulation
Toberadex		In House		Eye Ointment
10% Ferric Chloride		Ricca Chemical Company	3120-32	Thin-skull preparation
Microsurgical Blade		Sable Industries	S-6400	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 404,401		Loctite	P/N 46551	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 401		Loctite	P/N 40140	Thin-skull preparation
Zip Kicker Glue Accelerator		Pacer Technology	PT-29	Thin-skull preparation
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter		Fine Science Tools	19008-07	Thin-skull preparation
Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece		Ram Products, Inc.	TECH2000ON/OFF	Thin-skull preparation
#6-0 (0.7 metric ) silk suture		Ethicon Inc.	K8894H	Taper C-1
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved	Surgical Tools	Fine Science Tools	11152-10
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm	Surgical Tools	Fine Science Tools	14084-08
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	Surgical Tools	Fine Science Tools	11000-12