Summary
Dans ce matériel vidéo et complémentaires, nous montrons un protocole pour les maladies chroniques
Abstract
L'imagerie in vivo en utilisant microscopie à deux photons laser à balayage (2PLSM) permet l'étude des cellules vivantes et des processus neuronaux dans le cerveau intact. La technique présentée ici permet l'imagerie de la même zone du cerveau à différents moments (chronique d'imagerie) avec une résolution microscopique, permettant le suivi des épines dendritiques qui sont les petites structures qui représentent la majorité des sites de post-synaptiques excitateurs dans le SNC. La capacité à résoudre clairement fines structures corticales plus de points plusieurs fois a de nombreux avantages, en particulier dans l'étude de la plasticité du cerveau dans lequel les changements morphologiques au niveau des synapses et le remodelage du circuit peut aider à expliquer les mécanismes sous-jacents. Dans ce matériel vidéo et complémentaires, nous montrons un protocole pour l'imagerie in vivo chroniques du cerveau intactes en utilisant une préparation amincie crâne. La préparation éclaircis-crâne est une approche minimalement invasive, ce qui évite les dommages potentiels à la mère et / ou du cortex, réduisant ainsi le déclenchement d'une réponse inflammatoire. Lorsque ce protocole est réalisé correctement, il est possible de bien surveiller les changements dans les caractéristiques des épines dendritiques dans le cerveau intact sur une période de temps prolongée.
Protocol
- Pour visualiser les neurones dans le cerveau intact en utilisant microscopie à deux photons, une préparation où les neurones sont étiquetées avec des marqueurs fluorescents sont utilisés. Dans les expériences présentées ici, nous utilisons la ligne de la GFP-M de souris transgéniques dont les étiquettes couche 5 cellules pyramidales 1. Couche 5 cellules pyramidales de projet dans le processus dendritiques couches superficielles, permettant la visualisation des dendrites et des épines dendritiques jusqu'à une profondeur de 300 um en dessous du niveau de la pie. Une autre approche consiste à marquer les cellules en utilisant des marqueurs viraux (voir Lowery et al., Soumis à Zeus).
- Stériliser l'espace de travail en utilisant 70% d'éthanol et d'outils autoclave pour la chirurgie aseptique. Couvrir la surface avec exploitation pansement propre.
- Anesthetize souris avec un cocktail de fentanyl (fentanyl 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) suivie d'une dose quart de Avertin (0,0075 mg / ml) en utilisant IACUC procédures approuvées. Prétraitez souris avec l'analgésique, la buprénorphine (0,5 mg / kg) administré par voie sous cutanée (SQ). Surveiller le niveau du plan d'anesthésie par réaction des tests à la queue / tep pincement.
- Maintenir les animaux à 37,5 ° C en utilisant couverture chauffante avec thermomètre rectal ci-joint.
- Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter les yeux de se dessécher. Capuche avec les yeux petite feuille de papier pour protéger les yeux de la source lumineuse pendant la chirurgie.
- Avec des ciseaux, enlever les poils de l'arrière de la tête (derrière les oreilles) pour les yeux.
- Nettoyez le dessus de la tête de l'animal avec l'application séquentielle de l'éthanol à 70%, suivi par le maquis et la solution de bétadine bétadine.
- Faire une incision coupe en L derrière les oreilles et le long soit le côté droit ou gauche de la ligne médiane (en fonction de l'hémisphère dans lequel seront imagés) pour les yeux. Repliez la peau sur et loin du site de la chirurgie. Ne retirez pas la peau comme la peau sera suturé après la séance d'imagerie.
- En utilisant des pinces fines tirez doucement la peau et loin de votre zone d'intérêt.
- Doucement gratter le périoste de la zone exposée du crâne avec une pince ou une lame de nettoyage de microchirurgie. En utilisant un coton-tige, appliquez une petite quantité de chlorure ferrique 10% sur le crâne de sécher complètement la membrane du périoste et de s'assurer qu'il a été complètement supprimé. Il est important que le crâne est complètement sèche pour assurer adhérant correcte de la colle (voir 11). En utilisant une pince ou une lame de microchirurgie, doucement gratter la membrane du périoste séché.
- Appliquer une fine couche de colle cyanoacrylate autour de la fenêtre d'imagerie de la plaque de tête en acier inoxydable (voir figure 1) et y apposer la plaque sur le crâne.
- Utilisation de la fin de bois d'un bâton de coton-tige, appliquer la colle pour les coutures à l'intérieur de la fenêtre de l'imagerie; en veillant à combler toutes les lacunes entre la plaque d'imagerie et de la courbure du crâne.
- Déposer une goutte d'accélérateur colle dans la fenêtre. Vite essuyer accélérateur de l'excès de colle avec un coton-tige ou Kim essuyer. La colle doit être complètement solidifié avant de percer.
- Commencez à éclaircir le crâne dans la fenêtre d'imagerie utilisant une fraise de dentiste muni d'une bavure inox 0,7 mm d'acier. De forage en alternance avec l'application occasionnelle d'une solution saline stérile à 0,9% pour éviter de générer trop de chaleur sur le crâne.
- Mince une fenêtre 4x4 mm sur le crâne à l'aide de petits coups sur toute la surface du crâne avec la fraise de dentiste. Test de la minceur du crâne avec une pince extrémité émoussée. La surface du crâne sera tiret légèrement avec une légère pression. L'épaisseur du crâne optimale pour l'imagerie se situe entre 10 et 30 um.
- Lorsque le crâne est mince et la fenêtre nettoyé de tous les débris, placez saline sur le crâne. Photographie de la fenêtre d'imagerie avec une caméra numérique montée sur un microscope à dissection. Photographie et de l'utilisation de la vascularisation du cerveau vous aideront à localiser la position de placer la plaque d'imagerie pour les sessions ultérieures imagerie.
- Transports à l'animal de la plate-forme 2-photons. L'animal doit rester sur la couverture chauffante (avec une sonde rectale) lors de la session d'imagerie complet. Remarque: bien que sous sédation, la température de l'animal centrale du corps va fluctuer considérablement en l'absence d'une unité de chaleur résultant de lésions corticales ou éventuellement la mort.
- Un microscope à deux photons d'un laser Mai Tai, une pompe à l'état solide pour 10W de puissance maximale et une modification Olympus Fluoview confocale appareil est utilisé. Le système est optimisé pour l'imagerie des tissus profonds et des détecteurs externes sont installés le plus près de l'objectif que possible pour permettre la détection de la fluorescence maximale à partir du cerveau. Un Olympus FL LUMPlan / IR objectif 20X/0.95NA est utilisé. Saline à 0,9% est utilisé lors d'imagerie pour la submersion objectif.
- L'utilisation de ce microscope, et faible zoom numérique (x1) d'identifier une zone contenant des neurones vives étiquetés.
- L'utilisation d'un appareil photo numérique apposée sur l'oculaire de microscope, de prendre une photographie de la zone d'imagerie. Alternativement, esquisser le schéma vasculaire artérielle. Cela est nécessaire pour retourner vers l'emplacement d'imagerie mêmes à un point du temps ultérieur.
- Procurez-vous une pile faible grossissement (objectif x20, 512x512 pixels; étape 5 um) à travers toute l'étendue visible du cerveau (en général couvrant ~ 200 um) montrant l'étendue des ramifications dendritiques. Remarque: cette image faible grossissement sera utilisée pour localiser la zone d'imagerie à des moments ultérieurs que les deux vaisseaux sanguins et des dendrites maintenir leur structure chez les animaux jeunes et adultes.
- En utilisant un logiciel d'imagerie (Fluoview, v. 5.0, FV300), augmenter le grossissement numérique 8 fois. Réglez la coordonnées X, Y (pan coordonnées) si nécessaire et de recueillir une pile fort grossissement qui montrera détaillée morphologie dendritique, y compris les lieux et la structure des épines dendritiques. Prenez des notes détaillées sur chaque collection pile, c'est à dire pan coordonnées, la gamme de la collection, la taille z-étape et le nombre d'étapes dans votre pile. Ces notes seront utilisées lors du retour à cette dendrite ou axone à un point du temps ultérieur.
- Suite à l'imagerie, enlever la plaque de tête en douceur la séparation plaque de surface du crâne. En utilisant des pinces, enlever toute la colle résiduelle sur le crâne et essuyez la surface du crâne avec une solution saline stérile à 0,9%. Suture de la peau sur le crâne ensemble en utilisant # 6 fil de suture. Essuyez la zone avec de l'éthanol à 70%. Pour soulager la douleur lors de récupération post-opératoire, administrer 0,1 analgésiques buprénorphine mg / kg, la SQ.
- Placez animal en cage propre sous une lampe chauffante jusqu'à ce qu'elle se réveille et est mobile. Retour à la cage des animaux d'origine.
- Pour les animaux réimager à un point de temps plus tard (nos points imagerie en temps peut être n'importe où à partir de 2 jours à plusieurs mois d'intervalle), retirer des points ou la réouverture de la peau sur la tête en utilisant des méthodes d'asepsie comme ci-dessus. Utiliser l'image numérique du cerveau vasculaire (pris à la date première chirurgie) pour localiser l'emplacement d'imagerie original. Réapposer plaque frontale en acier inoxydable (étapes 10-12). Utilisez une lame mince de microchirurgie pour doucement l'écart tous les os qui pourrait avoir re-développé entre les points de l'imagerie en temps. Si nécessaire, diluer avec fraise de dentiste. Fenêtre d'imagerie exempt de débris et d'appliquer une goutte de solution saline stérile à 0,9%.
- Carry animal à deux photons de microscope et de localiser Imagerie d'origine. Utilisez la photographie numérique prises pendant la session d'imagerie première demande d'aide.
- Ouvrez le programme Fluoview et ouvrir l'image grossissement original faible. Apposer une feuille de transparence à l'écran de l'ordinateur et esquisser le profil sanguin majeur navire utilisant un stylo transparence.
- Ouvrez l'image en direct et de réaligner la vascularisation artérielle au schéma esquissé sur le film transparent.
- Pour l'réimager 8x zoom dans les structures, ouvrent la pile désirée recueillies auprès de la séance d'imagerie précédent. Esquisse de la structure (ie axonale, dendritiques, cellules gliales) sur un film transparent, apposée sur l'écran d'ordinateur.
- Zoom 8x à partir de l'image en direct et mettre la casserole coordonnées pour les premiers paramètres d'imagerie par jour. Selon la précision de l'alignement de l'emplacement à faible grossissement, il peut être aussi nécessaire de régler l'angle de l'image légèrement. Une fois la structure désirée est trouvée, correspondent à la structure de votre modèle esquissé un grossissement élevé. Recueillir le z-stack avec la taille de pas identiques et le nombre de Z-stack images pour une analyse ultérieure.
- Répétez les étapes 29 et 30 jusqu'à ce que toutes les images à fort grossissement sont re-collectées.
- Lorsque l'imagerie est terminée, répétez les étapes 22-24. Re-imagerie peut être répétée jusqu'à 2 points de temps séparés.
- Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements stipulés par le Vivarium et la division de médecine des animaux de laboratoire de l'Université de Rochester School of Medicine & Dentistry, en pleine accréditation par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins des animaux de laboratoire, International (AAALAC) et sont en conformité avec la loi d'Etat, une loi fédérale et la politique des NIH.
Les résultats représentatifs
Dans la GFP-M souris exprimant, un sous-ensemble de la couche 5 cellules pyramidales et correspondant processus dendritiques peuvent être facilement visualisés en utilisant 2-photons microscopie à balayage laser (2PLSM) 1. Ici, nous avons démontré une préparation éclaircis-crâne dans lequel le crâne sur l'emplacement désiré imagerie est amincie à ~ 10-30 um. Effectuée correctement, notre protocole nous a permis de visualiser clairement les dendrites et les épines corticale dans le cortex visuel intact pour l'analyse aiguë ou chronique (figure 2).
Figure 1. Tête de la coutume et la plaque de base (A). Vue du haut de la tête fait la coutume et la plaque de base utilisés pour la préparation chirurgie amincie crâne. Vue latérale (B) du sur-mesure tête et la plaque de base. (C, D) schéma détaillé et l'image de la plaque de tête.
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Discussion
D'imagerie utilisant chronique microscopie à deux photons est de plus en plus populaire d'une technique pour étudier les changements morphologiques déclenchée pendant 2-5 plasticité. Ici nous démontrons une préparation éclaircis-crâne à suivre identifié épines dendritiques dans le cerveau de souris intactes les jours d'imagerie. Dans ce protocole, le crâne est laissé intact, causant des dégâts minimes au cortex et résultant en des niveaux très bas de la neuroinflammation, qui peuvent altérer les fonctions cérébrales 6. Cela permet à l'animal d'être imagés immédiatement après la première chirurgie et jours suite à la reimaged ans plus tard. Ceci est une technique puissante, mais aussi a ses limites. La préparation de fenêtre plus invasive qui implique une craniotomie et donc associée activation gliale, permet l'imagerie du cerveau répéter avec un nombre arbitraire de sessions d'imagerie alors que la fenêtre crânienne est claire. La préparation du crâne minces, cependant, est limitée au plus à trois séances d'imagerie à cause de la chirurgie impliqués dans l'ouverture et la fermeture de peau de la souris. De plus, la profondeur de pénétration est supérieur dans les 2 fenêtre crânienne. Une attention particulière doit donc être pris au moment de décider de l'approche chirurgicale pour des expériences d'imagerie chronique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Prix Carrière Burroughs Wellcome dans les sciences biomédicales (AKM), La Fondation de recherche sur Whitehall Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM), et une IEN financé, formation Vision Grant, EY013319 ( EAK).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| Medetomindine Hydrochloride | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
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| Midazolam HCL | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
||
| 2,2,2-tribrom–thanol | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1% |
|||
| 2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%) | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775% |
|||
| TC-1000 Temp. Control System for Mice | CWE, Inc. | TC-1000 Mouse | Body Temp. Regulation | |
| Toberadex | In House | Eye Ointment | ||
| 10% Ferric Chloride | Ricca Chemical Company | 3120-32 | Thin-skull preparation | |
| Microsurgical Blade | Sable Industries | S-6400 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 404,401 | Loctite | P/N 46551 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 401 | Loctite | P/N 40140 | Thin-skull preparation | |
| Zip Kicker Glue Accelerator | Pacer Technology | PT-29 | Thin-skull preparation | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | Thin-skull preparation | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Thin-skull preparation | |
| #6-0 (0.7 metric ) silk suture | Ethicon Inc. | K8894H | Taper C-1 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11000-12 |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
