Summary
이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을 표시
Abstract
두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (2PLSM)를 사용하여 생체내 이미징에서 그대로 뇌 속에 살아있는 세포와의 연결 프로세스의 연구는 있습니다. 여기에 제공 기술은 CNS에 postsynaptic 흥분성의 사이트의 대부분을 나타내는 작은 구조 아르 돌기 쪽이의 추적을 허용하는 미세한 해상도 몇 시간 포인트 (만성 영상)에서 두뇌의 동일한 지역의 영상을 허용합니다. 분명 몇 시간 동안 지점 미세 외피 구조를 해결하는 능력은 시냅스 및 회로 개조의 형태학의 변화가 근본적인 메커니즘을 설명할 수 있도록 도와있는 뇌 소성의 연구에서 특히 많은 장점이 있습니다. 이 비디오 및 보조 자료에서 우리는 thinned - 해골 준비를 사용하여 손상 두뇌의 생체내 이미징에서 만성위한 프로토콜을 보여줍니다. thinned - 두개골 준비 따라서 염증 반응의 발병을 줄일 수 두라 및 / 또는 피질에 잠재적인 손상을 피할 수 법으로서 접근 방식입니다. 이 프로토콜이 올바르게 수행되면, 그것은 분명 시간의 장기간 동안 손상 두뇌에 돌기 척추 특성의 변화를 모니터링 할 수 있습니다.
Protocol
- 두 광자 현미경, 뉴런은 형광 마커로 표시하는 준비를 사용하여 손상 두뇌의 뉴런을 시각화하는 데 사용됩니다. 실험 여기서 소개 우리는 계층, 5 피라미드 세포 1 라벨 GFP - M 유전자 변형 마우스 라인을 사용합니다. 레이어 5 피라미드 세포는 피아의 수준 아래에 300 μm의 깊이 dendrites과 돌기 쪽이의 시각화를 허용, 표면 레이어로 돌기 프로세스를 프로젝트. 대체 접근법은 바이러스 마커를 (어리 외를 참조하십시오., 조브에 제출)를 사용하여 레이블 셀 수 있습니다.
- 무균 수술을 70 % 에탄올과 압력솥 도구를 사용하여 작업 영역을 소독. 깨끗한 드레싱과 표면을 운영 커버.
- IACUC 승인 절차를 사용 Avertin의 4 분의 1 분량 (0.0075 MG / ML)가 따랐다. 펜타 닐 칵테일 (;, midazolam 5 MG / kg metatomadin 0.5 MG / kg 펜타 닐 0.05 밀리그램 / kg)로 쥐를 마취 진통제와 함께 생쥐를 Pretreat, buprenorphine은 (0.5 밀리그램 / kg) (SQ) subcutaneously 관리. 꼬리 / 발가락 공략 테스트 반응에 의해 마취 비행기의 수준을 모니터링합니다.
- 37.5에서 동물을 유지 ° C 첨부된 직장 온도계와 가열 담요를 사용합니다.
- 밖으로 건조에서 눈을 방지하기 위해 눈 안과 연고를 적용합니다. 수술 중 광원으로부터 눈을 보호하기 위해 종이의 작은 시트와 후드 눈.
- 가위를 사용하여 눈 머리 뒤쪽 (귀 뒤쪽)에서 머리를 제거합니다.
- 70 % 에탄올의 연속적인 응용 프로그램과 함께 동물의 머리의 정상을 청소, betadine 스크럽과 betadine 솔루션으로 따라갔다.
- 눈 정중선 (몇 군데하게됩니다 반구에 따라 다름) 중 하나를 오른쪽 또는 왼쪽 귀 최대 뒤에 L - 컷 절개를합니다. 피부를 통해 접어 거리 수술 사이트에서. 피부가 이미징 세션 다음 봉합한다로 피부를 제거하지 마십시오.
- 좋은 집게를 사용하면 부드럽게 관심의 영역에서 피부를 당겨 멀리.
- 부드럽게 청소 포셉 또는 microsurgical 블레이드와 두개골의 노출된 영역에서 골막 멀리 다쳤어요. 면봉을 사용하여 완전히 골막 멤브레인을 건조하고 그것이 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 두개골에 10 % 산화철 클로라이드의 작은 금액을 적용합니다. 두개골 (11 참조) 접착제의 적절한 준수를 보장하기 위해 완전히 건조하는 것이 중요합니다. 포셉 또는 microsurgical 블레이드를 사용하여 부드럽게 멀리 말린 골막 막을 다쳤어요.
- 스테인리스 스틸 헤드 플레이트 (그림 1 참조)과 부착 두개골에 접시의 이미지 창 주위 cyanoacrylate 접착제의 얇은 레이어를 적용합니다.
- 솜 면봉 스틱의 나무 끝을 사용하여 이미지 창 안쪽 솔기에 접착제를 적용, 이미징 플레이트와 두개골의 곡률 사이의 모든 간격을 작성해야하고.
- 창에 접착제 가속기의 드롭 놓습니다. 빠르게 멀리 목화 면봉이나 김 닦아와 함께 여분의 접착제 가속기를 닦으십시오. 접착제가 완전히 드릴링 전에 확정되어야합니다.
- 0.7 mm 스테인레스 스틸 버와 부착된 치과 드릴을 사용하여 이미지 윈도우의 두개골을 얇은 시작합니다. 0.9 % 멸균 생리의 가끔 응용 프로그램과 함께 대체 드릴링이 두개골에 너무 많은 열을 발생하지 않도록합니다.
- 치과 드릴로 두개골 표면에 걸쳐 작은 스트로크를 사용하여 두개골의 얇은 4X4 mm의 창. 뭉툭한 끝 포셉와 두개골의 두께를 테스트합니다. 두개골 표면은 부드러운 압력으로 약간 들여쓰기됩니다. 이미징을위한 최적의 두개골 두께는 10 ~ 30 μm의 수 있습니다.
- 두개골이 얇은이고 윈도우, 모든 파편의 두개골에 호수 장소를 청소하는 경우. 해부 범위에 장착된 디지털 카메라로 이미지 창을 사진에 담아보세요. 두뇌 vasculature의 사진과 사용 이후의 영상 세션에 대한 이미징 플레이트 곳으로 위치를 찾는데 도움이됩니다.
- 2 - 광자 장비에 동물을 운송. 동물은 전체 영상 세션 동안 가열 담요 (직장 프로브)에서 유지됩니다. 참고 : 진정제를 맞았 는데도 있지만, 동물의 핵심 체온이 대뇌 피질의 손상 또는 사망 가능성의 결과 가열 장치의 부재에 크게 변동합니다.
- 마이 타이 레이저, 최대 전력 및 수정할 올림푸스 Fluoview 공촛점 단위에 대한 10W 고체 펌프와 함께 두 개의 광자 현미경이 사용됩니다. 시스템은 깊은 조직 이미징에 최적화되어 있으며 두뇌에서 형광의 최대한의 검출을 허용하는 최대한 외부 감지기는 목표에 가까이 설치됩니다. 올림푸스 LUMPlan 층 / IR 20X/0.95NA 목표 렌즈가 사용됩니다. 0.9 %의 염분이 목적을 위해 이미징 잠수하는 동안 사용됩니다.
- 이 현미경을 사용하고, 낮은 디지털 줌 (1 개)은 밝게 표시 뉴런을 포함하는 영역을 식별합니다.
- 현미경 아이 조각에 부착된 디지털 카메라를 사용하여 이미지 영역의 사진을 가져가라. 또는 혈액 vasculature 패턴을 스케치. 이것은 다시하는 것이 필요합니다이후 시점에 동일한 이미지 위치를 설정합니다.
- 돌기 분지의 범위를 보여주는 뇌 (보통 ~ 200 μm의를 스팬)의 전체 가시 범위를 통해, 낮은 배율 스택 (5 μm의 단계 x20 목표, 512x512 픽셀) 구합니다. 참고 :이 낮은 배율 이미지가 혈관과 dendrites 모두 젊은 성인 동물들의 구조를 유지하는 등 이후 시간 지점에서 이미지 영역을 찾습니다하는 데 사용됩니다.
- 이미징 소프트웨어 (Fluoview, V. 5.0, FV300)를 사용, 8 배 디지털 확대를 향상시킬 수 있습니다. X, Y 좌표 (팬 좌표) 필요한 경우를 조정하고 위치 및 돌기 쪽이 구조를 포함한 상세한 돌기 형태를 보여줍니다 높은 배율 스택을 수집합니다. 각 스택 컬렉션, 즉 이동 좌표, 수집, Z - 단계 크기 및 스택에서 단계의 숫자의 범위에 관한 자세한 메모를 가져가라. 이후 시점에서이 dendrite 또는 축삭를 다시 방문할 경우 이러한 노트가 사용됩니다.
- 이미지에 따라 부드럽게 두개골 표면에서 판을 분리하여 헤드 플레이트를 제거합니다. 포셉을 사용하여 두개골에 남아있는 잔여 접착제를 제거하고 0.9 % 멸균 식염수에 두개골 표면을 닦으십시오. # 6 suturing 스레드를 사용하여 함께 두개골을 통해 피부를 봉합. 70 % 에탄올로 영역을 닦아주십시오. 이후 수술 복구하는 동안 통증을 완화하기 위해, 0.1 MG / kg Buprenorphine의 진통, SQ를 관리할 수 있습니다.
- 가열 램프 아래에 깨끗한 케이지에 넣어 동물이 깨어나면 및 모바일 때까지. 원래 케이지로 동물을 반환합니다.
- 나중에 지점 (우리 이미징 시간 포인트가 2 일로부터 떨어져 여러 달 동안에 어디 에나있을 수 있음)에서 reimage 동물하려면, 실밥을 제거할 이상과 같은 무균 방법을 사용하여 머리에 피부를 다시 엽니다. 원래 이미지 위치를 찾습니다 두뇌 vasculature (첫 번째 수술 날짜에 촬영)의 디지털 이미지를 사용합니다. Reaffix 스테인리스 스틸 headplate (10-12 단계). 부드럽게 이미징 시간 지점 간의 다시 성장있을 수있는 뼈를 멀리 얇게하는 microsurgical 블레이드를 사용합니다. 경우, 필요한 치과 드릴 얇은. 지우기 이미징 파편의 창을 0.9 % 멸균 생리의 드롭을 적용합니다.
- 두 광자 현미경을 동물을 운반하고 원본 이미지 필드를 찾습니다. 도움 첫번째 이미지 세션 중에 찍은 디지털 사진을 사용합니다.
- Fluoview 프로그램을 열고 원래 낮은 배율 이미지를 엽니다. 접사 컴퓨터 화면과 스케치에 대한 투명성 시트 투명 펜을 사용하여 주요 혈관 패턴.
- 라이브 이미지를 열고 투명 필름 스케치 패턴 혈액 vasculature를 재개.
- 구조 확대할 8X를 reimage하려면 이전 이미지 세션에서 원하는 수집한 스택을 엽니다. 컴퓨터 화면에 부착된 구조 (glial, 돌기, 즉 axonal) 투명 필름에을 스케치.
- 라이브 이미지에서 8 배속으로 확대하고 냄비를 설정 첫날 이미징 매개 변수를 조정합니다. 낮은 배율 위치를 정렬의 정확성에 따라, 또한 약간 이미지의 각도를 조정해야 할 수도 있습니다. 원하는 구조가 발견되면 귀하의 스케치 높은 배율 패턴의 구조를 일치합니다. 후속 분석을 위해 Z - 스택 이미지의 동일한 단계의 크기 및 숫자와 Z - 스택을 수집합니다.
- 모든 높은 배율 이미지를 다시 수집 때까지 단계 29 30 단계를 반복합니다.
- 이미징이 완료되면, 반복 22-24 단계를 반복합니다. 다시 영상은 2 개의 분리된 시간 지점에서 최대 반복 수 있습니다.
- 동물 실험은 실험실 동물 관리의 평가와 인증을위한 협회에 의해 전체 인증에서 의학 및 치의학의 로체스터 대학의 실험실 동물 의학의 동식물 사육장과 본부가 정한 지침과 규정에 따라 수행되었습니다 주법, 연방 법령 및 NIH 정책을 준수 국제 (AAALAC)와 있습니다.
대표 결과
GFP - M 표현 생쥐에서 레이어 5 피라미드 세포 돌기와 해당 프로세스의 하위 집합은 쉽게 2 - 광자 레이저 스캐닝 현미경 (2PLSM 1)를 사용하여 시각하실 수 있습니다. 여기서 우리는 원하는 영상 위치에 걸쳐 두개골이 ~ 10-30 μm의에 thinned되는 thinned - 두개골 준비를 보여주었다. 제대로 수행, 우리 프로토콜은 우리가 명확하게 급성 또는 만성 분석 (그림 2)에 대한 손상 시각 피질에서 대뇌 피질의 dendrites 및 쪽이을 시각화 수있었습니다.
그림 1. 사용자 정의 머리와베이스 플레이트. thinned - 두개골 수술 준비에 사용되는 사용자 정의 만든 머리와베이스 플레이트의 (A) 톱 볼 수 있습니다. 맞춤 만든 머리와베이스 플레이트의 (B) 사이드 볼 수 있습니다. (C, D) 헤드 판에 대한 상세한 약도와 이미지.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
두 광자 현미경을 사용하여 만성 영상은 소성 2-5 동안 트리거 형태학의 변화를 연구하기 위해 점점 더 인기가 기술되고 있습니다. 여기 우리는 다른 이미징 일에 그대로 마우스의 뇌에 식별 돌기 쪽이에 따라 thinned - 두개골 준비를 보여줍니다. 이 프로토콜에서는 두개골은 피질에 최소한의 손상을 초래하고 두뇌 기능 6을 변경할 수도 있습니다 neuroinflammation 매우 낮은 수준의 결과로, 그대로 남아 있습니다. 이것은 동물이 바로 첫 번째 수술 후 나중 년 이후 reimaged 일 몇 군데 수 있습니다. 이 강력한 기술입니다뿐만 아니라 그 제한 사항이 있습니다. 두개골 창이 명확 동안 craniotomy하고 따라서 관련 glial 인증과 관련된 더 침입 창 준비, 이미지 세션의 임의의 숫자와 뇌의 반복 이미징 수 있습니다. 얇은 두개골 준비는 그러나, 마우스의 피부를 열고 닫기에 참여 수술로 인해 대부분의 세 이미지 세션으로 제한됩니다. 또한, 깊이 침투는 두개골 창 2 우수합니다. 만성 이미징 실험을위한 수술 방법을 결정할 때 신중하게 고려해야 따라서 이동해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 의생명 과학 (AKM)에 버로우즈 웰컴 경력 수상에 의해 지원되었다, 화이트홀 재단 연구 그랜트 (AKM), 슬로언 재단 원정대 (AKM), NIH EY019277 (AKM), 그리고 네이 자금, 비전 교육 그랜트 EY013319 ( EAK).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fentanyl Citrate | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
||
| Medetomindine Hydrochloride | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
||
| Midazolam HCL | In House | Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg |
||
| 2,2,2-tribrom–thanol | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1% |
|||
| 2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%) | Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775% |
|||
| TC-1000 Temp. Control System for Mice | CWE, Inc. | TC-1000 Mouse | Body Temp. Regulation | |
| Toberadex | In House | Eye Ointment | ||
| 10% Ferric Chloride | Ricca Chemical Company | 3120-32 | Thin-skull preparation | |
| Microsurgical Blade | Sable Industries | S-6400 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 404,401 | Loctite | P/N 46551 | Thin-skull preparation | |
| Cyanoacrylate 401 | Loctite | P/N 40140 | Thin-skull preparation | |
| Zip Kicker Glue Accelerator | Pacer Technology | PT-29 | Thin-skull preparation | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | Thin-skull preparation | |
| Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Thin-skull preparation | |
| #6-0 (0.7 metric ) silk suture | Ethicon Inc. | K8894H | Taper C-1 | |
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11000-12 |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Yang, G. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
