Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

Summary

Neste material de vídeo e suplementar, vamos mostrar um protocolo para a crônica

Abstract

In vivo de imagens utilizando dois fótons microscopia de varredura a laser (2PLSM) permite o estudo de células vivas e processos neuronais no cérebro intacto. A técnica apresentada aqui permite que a imagem da mesma área do cérebro em momentos diversos (imagem crônica) com resolução microscópica permitindo o rastreamento de espinhas dendríticas, que são as pequenas estruturas que representam a maioria dos pós-sináptica excitatória locais no sistema nervoso central. A capacidade de resolver claramente multa estruturas cortical sobre vários intervalos de tempo tem muitas vantagens, especificamente no estudo da plasticidade do cérebro em que as alterações morfológicas nas sinapses e remodelação do circuito pode ajudar a explicar os mecanismos subjacentes. Neste material de vídeo e suplementares, mostramos um protocolo para a crônica in vivo de imagens do cérebro intacto utilizando uma preparação diluída crânio. A preparação diluída crânio-se de uma abordagem minimamente invasiva, o que evita possíveis danos à dura e / ou córtex, reduzindo assim o aparecimento de uma resposta inflamatória. Quando este protocolo é realizado corretamente, é possível monitorar claramente mudanças nas características espinha dendrítica no cérebro intacto por um período prolongado de tempo.

Protocol

1. Para visualizar os neurônios no cérebro intacto utilizando dois fótons de microscopia, uma preparação, onde os neurônios são marcados com marcadores fluorescentes é utilizado. Nos experimentos apresentados aqui usamos o GFP-M linha camundongo transgênico que rotula camada 5 células piramidais ^1. Camada 5 células piramidais projeto processos dendríticos em camadas superficial, permitindo a visualização dos dendritos e espinhas dendríticas até uma profundidade de 300 mm abaixo do nível da pia. Uma abordagem alternativa é a células etiqueta usando marcadores virais (ver Lowery et al., Submetidos a JOVE).
2. Esterilizar o espaço de trabalho usando etanol 70% e as ferramentas de autoclave para a cirurgia asséptica. Cobrir operacional superfície com curativo limpo.
3. Anestesiar ratos com um cocktail (fentanil 0,05 mg / kg; midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) Fentanyl seguida de uma dose trimestre de Avertin (0,0075 mg / ml) usando IACUC procedimentos aprovados. Pré-tratamento camundongos com o analgésico, a buprenorfina (0,5 mg / kg) administrado por via subcutânea (SQ). Monitorar o nível de plano anestésico por reação de teste à cauda / tep pinch.
4. Manter animais em 37,5 ° C utilizando manta de aquecimento com termômetro retal em anexo.
5. Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar que os olhos sequem. Olhos capa com pequena folha de papel para proteger os olhos da fonte de luz durante a cirurgia.
6. Com uma tesoura, remover os pêlos da parte de trás da cabeça (atrás das orelhas) para os olhos.
7. Limpe a parte superior da cabeça do animal com a aplicação seqüencial de álcool 70%, seguido pelo matagal betadine e solução de betadine.
8. Faça uma incisão L cut-atrás das orelhas e ao longo de cada lado a direita ou esquerda da linha média (dependendo de qual hemisfério será fotografado) para os olhos. Dobre a pele durante e fora do local da cirurgia. Não retire a pele como a pele será suturada após a sessão de imagens.
9. Utilizando uma pinça fina puxe a pele para cima e longe de sua área de interesse.
10. Delicadamente raspar o periósteo da área exposta do crânio com uma pinça limpa ou lâmina de microcirurgia. Usando cotonete, aplique uma pequena quantidade de 10% de cloreto férrico ao crânio para secar completamente a membrana periósteo e garantir que ele tenha sido completamente removido. É importante que o crânio está completamente seca para garantir aderência adequada da cola (ver 11). Utilizando uma pinça ou lâmina de microcirurgia, delicadamente raspar membrana periósteo secas.
11. Aplicar uma fina camada de cola de cianoacrilato em torno da janela de imagem da placa de aço inoxidável cabeça (ver Figura 1) e apor a placa para o crânio.
12. Usando o final de uma vara de madeira de algodão do cotonete, aplique cola para costuras dentro da janela de imagem; certificando-se de preencher todas as lacunas entre a placa de imagem e curvatura do crânio.
13. Coloque uma gota de cola acelerador para a janela. Rapidamente enxugará acelerador excesso de cola com um cotonete ou kim wipe. A cola deve estar completamente solidificado antes da perfuração.
14. Começam a diluir o crânio na janela de imagem usando uma broca de dentista afixada com um 0,7 milímetros de aço inoxidável da rebarba. Perfuração alternam com aplicação ocasional de 0,9% estéril para evitar a geração de muito calor no crânio.
15. Fina uma janela de 4x4 mm no crânio usando pequenos acidentes vasculares cerebrais em toda a superfície do crânio com a broca de dentista. Testar a magreza do crânio, com fórceps fim brusco. A superfície do crânio vai travessão ligeiramente com uma leve pressão. A espessura do crânio ideal para geração de imagens é entre 10 e 30 mm.
16. Quando o crânio é fina e limpa a janela de todos os detritos, coloque soro fisiológico no crânio. Fotografia da janela de imagem com uma câmera digital acoplada a um escopo de dissecação. Fotografia e uso da vasculatura cerebral irá ajudar na localização da posição de colocar a placa de imagem para as sessões de imagem subseqüentes.
17. Transportar o animal para a plataforma 2-fótons. O animal deve permanecer sobre o cobertor de aquecimento (com sonda retal) durante a sessão de imagens completo. Nota: enquanto estiver sob sedação, a temperatura corporal do animal núcleo irá variar enormemente na ausência de uma unidade de aquecimento, resultando em danos cortical ou possivelmente a morte.
18. Um microscópio de dois fótons com um Tai Mai laser, uma bomba de estado sólido para 10W de potência máxima e um modificado Olympus FluoView unidade confocal é usado. O sistema é otimizado para imagens de tecidos profundos e detectores externos estão instalados o mais próximo do objetivo possível para permitir a detecção de fluorescência máxima a partir do cérebro. Uma Olympus LUMPlan fl / IR lente objetiva 20X/0.95NA é usado. Salina 0,9% é usado durante o exame para submersão objetivo.
19. Usando este microscópio, e zoom digital de baixo (x1) identificar uma área que contém neurônios brilhantemente rotulados.
20. Usando uma câmera digital aposta no ocular do microscópio, tirar uma fotografia da área de imagem. Alternativamente, esboçar o padrão de vascularização sanguínea. Isso é necessário para rese voltam para a localização de imagens mesmo em um ponto posteriormente.
21. Obter uma pilha de baixa ampliação (x20 objetivo, pixel 512x512; 5 passos mm) através de toda a extensão visível do cérebro (geralmente medindo ~ 200 mm) que mostram a extensão de ramificação dendrítica. Nota: esta imagem baixa ampliação será usado para localizar a área de imagem em momentos subseqüentes como vasos de sangue e dendritos manter sua estrutura em animais jovens e adultos.
22. Usando o software de imagem (FluoView, v. 5.0, FV300), aumento ampliação digital de 8 vezes. Ajustar as coordenadas X, Y (pan coordenadas) se necessário e recolher uma pilha alta ampliação que irá mostrar morfologia dendrítica detalhadas, incluindo a localização e estrutura das espinhas dendríticas. Tomar notas detalhadas sobre cada coleção pilha, ou seja, pan coordenadas, o intervalo de coleta, o tamanho z-passo e o número de passos na sua pilha. Essas notas serão utilizados quando voltar a este dendrite ou axônio em um ponto posteriormente.
23. Seguinte imagem, retire a placa de cabeça suavemente separando placa da superfície do crânio. Utilizando uma pinça, remova qualquer cola residual restante no crânio e limpe a superfície do crânio, com 0,9% salina estéril. Sutura da pele sobre o crânio em conjunto, utilizando fio de sutura # 6. Limpe área com álcool 70%. Para aliviar a dor durante a recuperação pós-operatória, administrar 0,1 analgésico Buprenorfina mg / kg, SQ.
24. Coloque animal em gaiola limpa sob uma lâmpada de calor até que acorda e é móvel. Retorno animal para gaiola original.
25. Para recriar animais em um ponto mais tarde (tempo os nossos pontos de imagem pode estar em qualquer lugar de 2 dias a muitos meses de intervalo), remover pontos ou reabrir a pele na cabeça, usando métodos de assepsia como descrito acima. Use a imagem digital do cérebro vascular (tomadas na data da primeira cirurgia) para localizar o local de imagem original. Reafixar aço inoxidável headplate (passos 10-12). Use uma lâmina fina de microcirurgia para suavemente afastado qualquer osso que poderia ter re-grown entre os pontos de tempo de imagem. Se necessário, magro, com broca de dentista. Janela de imagem livre de detritos e aplicar uma queda de 0,9% salina estéril.
26. Transportar animais para microscópio de dois fotões e localizar campo de imagem original. Use a fotografia digitais tiradas durante a sessão primeira imagem para obter assistência.
27. Abra o programa FluoView e abrir a imagem ampliação original baixa. Juntar uma folha de transparência para a tela do computador e esboçar o padrão navio grande de sangue usando uma caneta de transparência.
28. Abra a imagem ao vivo e realinhar a vasculatura de sangue para o padrão esboçado no filme transparência.
29. A nova imagem do zoom 8x em estruturas, abrir a pilha desejada coletados a partir da sessão de imagem anterior. Esboço da estrutura (ie axonal, dendríticas, glial) em um filme de transparência, aposta no ecrã do computador.
30. Zoom em 8x da imagem ao vivo e definir o pan coordenadas para os parâmetros de imagem primeiro dia. Dependendo da precisão de alinhar a localização de baixa ampliação, pode ser necessário também ajustar o ângulo da imagem ligeiramente. Uma vez que a estrutura desejada, igualar-se a estrutura para o seu padrão de ampliação esboçou alta. Recolher o z-stack com o tamanho do passo idêntico e número de z-stack imagens para análise posterior.
31. Repita os passos 29 e 30 até todas as imagens de alta ampliação são recolhidas.
32. Quando imagem é completo, repita os passos 22-24. Re-imagem pode ser repetido em até 2 pontos no tempo separados.
33. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Divisão de Biotério e Laboratório de Medicina Animal da Universidade de Rochester Faculdade de Medicina e Odontologia, na acreditação plena pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care, internacional (AAALAC) e estão em conformidade com a lei estadual, lei federal e da política NIH.

Resultados representante

Em GFP-M camundongos expressando, um subconjunto de células piramidais da camada 5 e correspondentes processos dendríticos podem ser facilmente visualizadas usando dois-fotão microscopia de varredura a laser (2PLSM) ^1. Aqui nós demonstramos uma preparação diluída crânio-em que o crânio sobre a localização de imagem desejada é diluído em ~ 1-30 mM. Realizado corretamente, o nosso protocolo permitiu visualizar claramente dendritos corticais e espinhas no córtex intacto visual para análise aguda ou crônica (Figura 2).

Figura 1. Cabeça personalizado e placa de base. (A) Vista de cima da cabeça feitos sob encomenda e placa de base utilizado para desbaste crânio-preparação da cirurgia. (B) Vista lateral do feito por cabeça e placa de base. (C, D) esquemático detalhado e imagem da placa de cabeça.

in vivo no córtex visual de um rato GFP-M transgênicos utilizando dois fótons de microscopia. Imagem é uma projecção de imagem única obtidas a cada 5 mM da pia a uma profundidade final de 175 mM. A área de box em A representa a região ampliada em (B) e (C) com imagens no dia 0 (D0) e quatro dias depois (D4). (D, E) Maior aumento do ramo dendríticas encaixotado em B e C demonstrando espinhas estável (cabeças de seta branca), perdeu as espinhas / retracção (cabeças de seta vermelha) e espinhas novo (cabeças de seta verde). Barra de escala = 200 mM A., B, C. 20 M, D, E. 5 mm.

Discussion

Imagem crônica utilizando dois fótons de microscopia está se tornando uma técnica cada vez mais popular para estudar alterações morfológicas desencadeadas durante ^2-5 plasticidade. Aqui nós demonstramos uma preparação diluída crânio-a seguir identificados espinhas dendríticas no cérebro do rato intacta nos dias de imagens diferentes. Neste protocolo, o crânio é deixada intacta, causando danos mínimos para o córtex, resultando em níveis muito baixos de neuroinflamação que podem alterar a função cerebral ^6. Isto permite que o animal a ser trabalhada imediatamente após a primeira cirurgia e depois posteriormente reimaged dias para anos mais tarde. Esta é uma técnica poderosa, mas também tem suas limitações. A preparação janela mais invasivo que envolve uma craniotomia e, portanto, associada a ativação glial, permite repetir imagem do cérebro com um número arbitrário de sessões de imagem enquanto a janela cranial é clara. A preparação crânio fino, no entanto, é limitado a no máximo três sessões de imagem devido à cirurgia envolvidos na abertura e fechamento da pele do rato. Além disso, a penetração em profundidade é superior no ² Janela craniana. Consideração cuidadosa deve ser tomado ao decidir a abordagem cirúrgica para experimentos com imagens crônica.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Fentanyl Citrate		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Medetomindine Hydrochloride		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
Midazolam HCL		In House		Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; IP Dose: 0.0125 ml/g Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg
2,2,2-tribrom–thanol				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)				Avertin Cocktail: Anesthetic; IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
TC-1000 Temp. Control System for Mice		CWE, Inc.	TC-1000 Mouse	Body Temp. Regulation
Toberadex		In House		Eye Ointment
10% Ferric Chloride		Ricca Chemical Company	3120-32	Thin-skull preparation
Microsurgical Blade		Sable Industries	S-6400	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 404,401		Loctite	P/N 46551	Thin-skull preparation
Cyanoacrylate 401		Loctite	P/N 40140	Thin-skull preparation
Zip Kicker Glue Accelerator		Pacer Technology	PT-29	Thin-skull preparation
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter		Fine Science Tools	19008-07	Thin-skull preparation
Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece		Ram Products, Inc.	TECH2000ON/OFF	Thin-skull preparation
#6-0 (0.7 metric ) silk suture		Ethicon Inc.	K8894H	Taper C-1
Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved	Surgical Tools	Fine Science Tools	11152-10
Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm	Surgical Tools	Fine Science Tools	14084-08
Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm	Surgical Tools	Fine Science Tools	11000-12