Summary
Diese visualisiert Experiment ist ein Leitfaden für die Verwendung eines fluoreszierenden molekularen Klon des HIV für Live-konfokale Abbildung Experimente.
Abstract
Durch die Fusion des grün fluoreszierenden Proteins, um ihre Lieblings-Proteine, Biologen haben jetzt die Möglichkeit zu studieren lebende komplexen zellulären Prozesse mittels Fluoreszenz-Video-Mikroskopie. So verfolgen die Bewegungen des humanen Immundefizienz-Virus-Core-Protein während der Zell-Zell-Übertragung des Humanen Immundefizienz-Virus, haben wir die Gag-Protein in Zusammenhang mit einer infektiösen molekularen Klon von HIV, genannt HIV Gag-iGFP GFP-markierten. Wir untersuchen diese virale Klon mit Video-konfokale Mikroskopie. In den folgenden visualisiert Experiment transfizieren wir eine menschliche T-Zell-Linie mit HIV Gag-iGFP, und wir nutzen fluoreszenzmarkierten infizierten CD4 + T-Zellen als Zielzellen für das Virus dienen. Anhand der unterschiedlichen fluoreszierenden Markierungen wir ohne weiteres folgen virale Produktion und den Transport über interzelluläre Strukturen können als virologische Synapsen. Einfache gasdurchlässige Bildgebung Kammern ermöglichen es uns, Synapsen mit Live-konfokale Mikroskopie von Minuten bis Tagen zu beobachten. Diese Ansätze können verwendet werden, um virale Proteine verfolgen, wie sie in von einer Zelle zur nächsten zu bewegen.
Protocol
Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet Hübner et al Wissenschaft 323:. 1743-1747 (2009) .
1. Überblick
Zell-Zell-Ausbreitung von HIV wurde ursprünglich beschrieben mit HIV infiziert Jurkat-Zellen als Spenderzellen und primäre CD4 + T-Lymphozyten als Akzeptor Zellen 1,2,3. In diesen Studien wurde das Virus in fixierten Zellen mittels Antikörper-Färbung festgestellt. So verfolgen die Übertragung des Virus von Zelle zu Zelle in lebenden Zellen, nutzen wir ein rekombinanter, infektiöser molekularer Klon von HIV genannt HIV Gag-iGFP 4. Es trägt das grün fluoreszierende Protein (GFP) intern in die Gag-Protein zwischen den MA und CA-Domains eingeführt. Dieser molekulare Klon von HIV behält Infektiosität ohne die Notwendigkeit für Helfervirus. Viruspartikel aus diesem Klon gemacht werden stöchiometrisch mit dem grün fluoreszierenden Protein geladen und bietet eine starke Fluoreszenz-Signal auf virale Montage und zwischen Zellen zu überwachen. Wenn in Verbindung mit inerten Zell-Tracking Fluoreszenzfarbstoffen, Empfänger-Zellen können aus Eingangs-Spenderzellen diskriminiert werden, und so dass man für die Übertragung von HIV von einer infizierten T-Zellen zu einem nicht infizierten T-Zelle 5 zu visualisieren. Virologische Synapsenbildung und Übertragung des Virus von einer Zelle zur anderen kann dann in lebenden Zellen beobachtet werden, während sie in einem verschlossenen, gasdurchlässige Bildgebung Kammer kultiviert werden.
(Tag 1)
2. Vorbereitung von HIV Gag-iGFP transfizierten Jurkat T-Zellen
- Bereiten Sie die menschlichen CD4 + T-Zelllinie Jurkat (ATCC, Manassas, VA) durch eine sorgfältige Pflege der Zellen bei einer Konzentration zwischen 2 x 10 5 und 8 x 10 5 Zellen / ml in Jurkat Kulturmedien (RPMI 1640, 10% fötalem Rinderserum, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / mL Streptomycin). Der Schlüssel zum Erfolg: Kultur der Jurkat-Zellen bei Konzentrationen von über 8 x 10 5 Zellen / ml wird in einer Verringerung der Transfektionseffizienz führen.
Hinweis: Die Transfektion von HIV Gag-iGFP Provirus-DNA in T-Zellen, wie unten beschrieben, führt zur Produktion von ein Replikations-kompetenten humanen Immundefizienz-Virus. Als solche sind alle Verfahren, die nur von geschultem Laborpersonal in zertifizierten Sicherheitsstufe 2 + oder Biosicherheitsstufe 3 (BL2 + / BL3) Gewebekultur Zimmer vorgenommen werden. Arbeiten mit infektiösen HIV in bildgebenden Einrichtungen muss von Ihrem lokalen institutionellen Biosicherheit genehmigt werden. - Transfizieren die Jurkats mit der viralen Plasmid, HIV Gag-iGFP mit dem Amaxa Nukleofektion Methode (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 150 x g. Saugen Sie den Überstand und die Zellen in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Zentrifugieren Sie die Zellen und das Pellet zu 97 ul vorgewärmtes, Nucleofector Lösung V mit dem Hersteller zu ergänzen. Fügen Sie drei ul von Endotoxin kostenlose HIV-Gag-iGFP Plasmid (1 pg / mL) zu der Zellsuspension und vorsichtig mischen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine Küvette und nucleofect mit dem Programm S-18. Sofortüberweisung die Zellen 3 ml vorgewärmtem Jurkat Kulturmedien ohne Antibiotika.
- Zur Vorbereitung CD4 + Zielzellen für die virologische Synapsen, erhalten wir humanen peripheren mononukleären Zellen aus Buffy Coats mit Hilfe eines Standard-Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Schweden)-Protokoll. CD4 + T-Zellen werden dann negativ gewählt mit Hilfe eines magnetischen Beads Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Diese können kryogen in flüssigem N2 in Aliquots von 5 x 10 6 cells/500 ul des Einfrierens Medien (90% fötalem Rinderserum serum/10% DMSO) gespeichert werden. Aufgetaut primären CD4 + T-Zellen werden in RPMI 10% FBS, mit 10 Einheiten / ml IL-2 kultiviert.
(Tag 2)
3. Rückgewinnung von lebenden Zellen aus Jurkats mit HIV Gag-iGFP und Färbung der Zielzellen mit Fluoreszenzfarbstoffen Transfizierte
- Lassen Sie die Jurkat-Zellen aus der Transfektion über Nacht erholen. Dann entfernen Sie die Zelltrümmer durch Zentrifugation über einen Ficoll Hypaque Dichtegradienten Material. Dispense 1,5 ml Ficoll-Paque, um den Boden eines 15 ml konischen Rohr. Gently Overlay dieses Gefälle Material mit den transfizierten Jurkats in einer 5-ml Volumen RPMI. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 xg für 20 min bei Raumtemperatur mit der Bremse ausgeschaltet. Entfernen Sie vorsichtig die Zellen aus dem media / Ficoll-Schnittstelle mit einer Pipette. Übertragung auf einen neuen 15 ml konischen Rohr. Verdünnen Sie die Zellen mit RMPI auf ein Gesamtvolumen von 15 ml und bei 300 g zentrifugiert für 10 min. Das Pellet in 3 ml Jurkat Kulturmedien in einer 2 cm gut (6-Well-Platte) und geben die Zellen der Gewebekultur-Inkubator.
- Zur Unterscheidung Zielzellen von Spenderzellen in Zell-Zell-Transfer-Experimenten haben wir prelabel der CD4 + Zielzellen mit Fluoreszenzfarbstoffen. Primäre CD4 + T-Zellen sind die sogar alsIng. vor dem Gebrauch. Wir haben ausgezeichnete Erfolge Kennzeichnung T-Zellen sowohl mit CellTracker und CellTrace Farbstoffe (Invitrogen, Carlsbad, CA) hatte. Während der Farbstoffkonzentration und Inkubationszeiten müssen optimiert, je nach den besonderen Farbstoff und Zelltyp verwendet werden, folgt eine repräsentative Protokoll. Pellet 4 x 10 6 primären CD4 + T-Zellen durch Schleudern bei 400 xg für 10 min. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS resuspendieren und in 2 ml PBS. Add CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) auf eine Endkonzentration von 1,5 um und bei 37 ° C für 20 min. 8 ml komplette Jurkat Medien und Zentrifuge bei 400 xg für 10 min. Resuspendieren der Zellen in 3 ml komplettem Medium mit 10 Einheiten / ml IL-2 und in der Gewebekultur-Inkubator über Nacht ergänzt.
(Tag 3)
4. Überwachung Zell-Zell-Transfer von HIV Gag-iGFP mit Live Cell Imaging
Wir verwenden routinemäßig HIV Gag-iGFP transfizierten Jurkat-Zellen 48 Stunden nach der Transfektion. Allerdings haben wir erfolgreich Zellen bereits nach 24 Stunden benutzt, und so spät wie 72 Stunden nach der Transfektion.
- Etwa 48 Stunden nach der Transfektion werden HIV Gag-iGFP Ausdruck Jurkats gezählt, gewaschen mit CO 2-unabhängigen Medien (Invitrogen, Carlsbad, CA), und erneut im Live Cell Imaging Medien (CO 2 unabhängige Medien, 10% fötalem Rinderserum, 100 U / mL Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, 10 Einheiten / ml IL-2) in einer Konzentration von 1-3 x 10 7 Zellen / ml.
- In ähnlicher Weise, waschen und resuspendieren markierte primäre CD4 + T-Zellen bei einer Konzentration von 1-3 x 10 7 Zellen / ml im Live Cell Imaging Medien.
- Mix HIV Gag-iGFP-transfizierten Jurkats mit primären CD4 + T-Zellen bei einer 1:2 oder 1:3 Verhältnis und Last in einer Gewebekultur behandelt, gasdurchlässigen, Mikrokammer (ibidi, Verona, WI). Zum Beispiel, mix 20 ul von HIV Gag-iGFP transfizierten Jurkats mit 40 ul der markierten primären CD4 + T-Zellen. Legen Sie 50 ul dieser Mischung in ein ibidi Kammer und Dichtung der Kammer mit Steckern. Sichern Sie den Stecker durch Umwickeln der Stecker / ibidi Kammer-Schnittstelle mit Parafilm.
5. Überlegungen für die Mikroskopie Plattformen: Spinning-Disk-konfokale Abbildung
Nach dem Laden eines ibidi Bildgebung Kammer mit Zellen, haben wir sofort Montieren Sie das Gerät auf einer invertierten optischen Mikroskop (IX71 Olympus, Center Valley, PA). Die ibidi Kammer sollte das Mikroskop nur durch BL2 +-qualifiziertem Laborpersonal Tragen geeigneter Schutzkleidung übertragen werden. Obwohl live-cell imaging häufigsten verwendet teure Inkubationskammern, um eine stabile 37 ° C Umgebung zu erhalten, diese wurde mit einer einfachen und kostengünstigen Thermostat Heizung (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) zusammen mit einem T-Typ Thermoelement Spitze montiert neben die Probe für die richtige Temperatur Feedback. Wir haben festgestellt, mit CO 2-unabhängigen Medien uns zu hohen Zellvitalität zu halten bei gleichzeitiger Vermeidung der Verwendung eines CO 2-Kammer ermöglicht. Um die Plattform gegen Temperaturschwankungen im Raum Puffer und zu blockieren, die Hintergrund Licht ausgesetzt, so ist ein großer schwarzer Schleier über das ganze Mikroskop / Heizung Setup Erstellung einer isolierten Luftblase rund um das System drapiert. Dies reduziert Temperaturschwankungen und der damit verbundenen Temperatur-bezogene Probe Drift, sondern erfordert eine Vorwärmung für 30 Minuten vor dem Einbau der Probe.
6. Data Acquisition, Transfer-und Bildverarbeitung
Die Bilder sind aufgenommen mit einem 60x 1,42 NA Ölimmersionsobjektiv (UPlanApo N, Olympus), als der hohen numerischen Apertur (NA) erheblich verbessert die Auflösung. So erstellen Sie 3D-konfokale Bilder, ist das Scannen von einer sich drehenden Scheibe konfokalen Einheit (CSU-10, Yokagawa, Japan), die gleichzeitig verwendet> 800 konfokalen Spots zu einem dramatischen Anstieg der Abtastrate durchgeführt. Zur Ergänzung seiner Geschwindigkeit, die CSU-10 ist mit einem hochempfindlichen Elektron-Multiplikation berechnet-coupled device (EMCCD, iXon + 897, Andor Technologies, Irland) Kamera auf schnelle, leichte Bildgebung, die sowohl Bleichen und Phototoxizität reduziert damit gepaart. Die Fluoreszenz-Lichtquelle ist ein Multi-Wellenlängen-ARKR Ionen-Gaslaser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), wo die gewünschten Wellenlänge (488 nm) und Laserleistung direkt vor dem Mikroskopobjektiv (<1 mW) gemessen werden von einem ausgewählten akusto- optischen abstimmbaren Filter (AOTF), (Andor Technologies). Zur weiteren Reduzierung Ausbleichen und zu erweitern Total imaging Zeit, schaltet sich der AOTF schnell (Mikrosekunden) aus dem Laserstrahl jedes Mal, wenn die Kamera nicht aktiv ist (10-20 ms), während die neu erworbene Bild von der CCD (15-30 ms Belichtungszeit) geliefert wird, auf den Computer. Das Laserlicht wird in die sich drehende Scheibe-System mit einem 405/488/568/647 Quadband dichroitischen Spiegel (Semrock, Rochester, NY) gekoppelt. Fluoreszenzemission wird gefiltert mit einem 525/50 Bandpassfilter (Semrock) in einem Filterrad (Ludl Electronic Products, Hawthorne, NY) montiert bVergleicht man die EMCCD Kamera und die konfokale Spinning-Disk-Einheit. Alle verwendeten Hard-und Übernahme, einschließlich einer z-Phase (Mad City Labs, Madison, WI), werden durch die Andor iQ v1.8 Software gesteuert. Um die Geschwindigkeit des Erwerbs von rund 1,2-1,9 zweite 3D Bildstapel zu maximieren, Ernte wir die Aufnahme Region des EMCCD Kamera bis auf die Zell-Paar der unmittelbaren Umgebung. Darüber hinaus auf Kosten der einige Informationen in z kann eine große z-Schritt zwischen 0,45-0,75 um zur Beschleunigung Akquisition werden. Imaging unter diesen Bedingungen kann bis zu 6 Stunden - mit kontinuierlichen 20-60 Minuten-Segmente - mit minimalem Ausbleichen. Insgesamt jedes Datensegment in der Regel nimmt 5-20 GB Speicherplatz als Zehntausende von Bildern getroffen werden. Zur Erleichterung des Transports und der Analyse der großen Datendateien, muss jeder Erwerb eingestellt abgebaut und exportiert als 1 Gb TIFF-Image-Datei-Segmente mit dem Andor iQ v1.8 Software. Von hier aus sind viele ausgezeichnete Software-Pakete für Bildanalyse, wie Metamorph, Volocity und ImageJ (wir empfehlen ihre Variation Fiji).
Wenn zwei fluoreszierenden Markern verfolgt werden soll, haben wir gleichzeitig aufnehmen beide ohne zu verlangsamen Übernahme durch eine "Split-Screen-Modus." Beide Marker werden durch zwei verschiedene ARKR Laserlinien auf einmal (oft 488 und 568 nm) angeregt. Direkt vor dem EMCCD Kamera wird ein Bild Splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK), dass die beiden unterschiedlichen Bilder trennt eingefügt. Jedes Bild wird dann unabhängig gefiltert mittels Fluoreszenz-Filter (Semrock) und projiziert side-by-Side an der Kamera auf einmal die Schaffung der "split-screen"-Effekt. Dies würde dann eine manuelle Zuschneiden und Ausrichten der Bilder später in der Bildverarbeitung.
7. Überlegungen für die Bildverarbeitung und Datenanalyse
Wir arbeiten typischerweise Bildanalyse mit Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) auf Macintosh-Computern (Apple, Inc). Spinning Disk Laser konfokalen Mikroskopie-Aufnahmen werden zunächst in ihrer Intensität angepasst werden, um für Bleichen, dann mit Volocity entfalteten korrigieren. Intensitätsmessungen und Verfolgung von Gag puncta mit dem Volocity Quantifizierung Modul durchgeführt. Bei Bild-Sets, bei denen die Bewegung relativ zu einem vorgeformten Synapse muss berechnet werden, ist ein automatisiertes Tracking-Algorithmus eingesetzt werden, die Spuren der synaptischen Taste während der gesamten Sequenz. Manuelle Kontrolle der Regionen von Interesse durch die Nachführung Software definiert werden muss durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die Software richtig auf das gewünschte Objekt verfolgt werden. Für Objekte, bei denen der Kontrast mit der umgebenden Objekte zu schwach ist, kann die manuelle Abtastung auf einer Frame-by-Frame-Basis durchgeführt werden. Die Volocity Software-Paket ermöglicht den Export von XYZ Lage, das Volumen und integrierte Signal innerhalb der gewünschten Objekte. Der Abstand von der Synapse und die Geschwindigkeit des verfolgten Objekts werden durch die Normalisierung der Bewegungen in die Mitte der synaptischen Button berechnet.
8. Repräsentative Ergebnisse
Innerhalb von 10 bis 15 Minuten Mischen sollte man in der Lage sein HIV Gag-iGFP Ausdruck Jurkat-Zellen anhaftende primäre CD4 + T-Zellen zu visualisieren. Imaging diese Konjugate, kann man die Bewegungen der Gag Punkte in infizierten Zellen sowie in Zielzellen nach synaspe beurteilen. Man kann die Bewegung des Gag-iGFP puncta in Zielzellen bald bemerken, nachdem Synapsen gebildet werden.
Discussion
Wir beschreiben hier eine einfache Methode zur Visualisierung der Übertragung von HIV von der Zell-Zell. Neuere Forschungen aus unserem Labor und andere "legt nahe, dass dies die vorherrschende Form der HIV zwischen T-Zellen verteilt werden. Die hier beschriebene Methode nutzt eine rekombinante Form des HIV, genannt HIV Gag-iGFP, die einen genetisch kodierte grün fluoreszierendes Protein-Tag in den Kern Strukturprotein, Gag trägt. Aufgrund des hohen Niveaus der GFP in jedem Viruspartikel produziert, ermöglicht diese Replikations-kompetente Klon von HIV-Forscher an einzelne Viruspartikel in Echtzeit zu verfolgen. Dieser Virus sollte besonders nützlich in Studien über die Montage-und Zell-Zell-Transfer von HIV.
Die Übertragung von HIV durch Zell-Zell-Transfer ist sehr effizient. Während einer dreistündigen Co-Kultur, Routine sehen wir Virus auf 20-30% der primären T-Zellen übertragen, wie mittels Durchflusszytometrie untersucht. Ähnliche Effizienzsteigerungen sind qualitativ im Live Cell Imaging gesehen. Viral infizierte T-Zellen beginnen bilden Synapsen mit infizierten primären T-Zellen fast unmittelbar nach der Einleitung des Co-Kultur. Interessant sind nicht alle primären T-Zellen zur Wechselwirkung mit HIV-infizierten Jurkat-Zellen trotz gezwungen Interaktionen mit Laser-Pinzette (unveröffentlichte Beobachtungen, GM). HIV Gag-iGFP wird zweifellos nützlich für die Bestimmung T-Zell-Subsets, die am anfälligsten für Zell-Zell-Transfer, sowohl in vitro und in vivo sind.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Prüfung wurde von den National Institutes of Health gewährt, AI074420-02, Burroughs Wellcome Investigator Award, Hirschl Karriere Scientist Awards zu BKC und von der NSF Center for Biophotonik Science and Technology, Cooperative Agreement PHY012099 und ein UCD Health System Research Award an TH unterstützt UCD CTSC NCRR ULRR024146.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jurkat T Cells | ATCC | ||
| Leukocyte buffy coats from whole blood | New York Blood Center | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich | ||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | ||
| Nucleofector System and Solution V | Lonza Inc. | ||
| EndoFree Maxi Prep Kits | Qiagen | ||
| HIV Gag-iGFP plasmid | Chen Laboratory | ||
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | ||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | ||
| Celltracker/CellTrace Dyes | Invitrogen | ||
| CO2-Independent Media | Invitrogen | ||
| Imaging Chambers | Ibidi | ||
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | Olympus Corporation | ||
| PlanApo N 1.42NA 60X oil objective | Olympus Corporation | ||
| Innova 70C ArKr ion gas laser | Coherent Inc. | ||
| CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit | Yokogawa | ||
| Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter | Semrock | ||
| 525/50 bandpass filter | Semrock | ||
| iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera | Andor | ||
| ASI 400 Thermostatic Heater | Nevtek |
References
- Blanco, J. High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells. J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).
- Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes. J Virol. 81, 1000-1012 (2007).
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- Hubner, W. Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses. Science. 323, 1743-1747 (2009).
