Summary
ניסוי זה הוא מדריך חזותי עבור ניצול שיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV עבור לחיות ניסויים הדמיה confocal.
Abstract
לפי פיוזינג חלבון פלואורסצנטי ירוק לחלבונים האהובים עליהם, ביולוגים עכשיו יש את היכולת ללמוד לחיות תהליכים תאיים מורכבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וידאו. כדי לעקוב אחר תנועות של חלבון הליבה וירוס הכשל החיסוני האנושי במהלך התא אל התא העברת נגיף האיידס, יש לנו GFP-tagged החלבון Gag בהקשר של שיבוט מולקולרי זיהומיות של HIV, הנקרא HIV-Gag iGFP. במחקר זה אנו שיבוט ויראלי באמצעות מיקרוסקופ וידאו confocal. בניסוי דמיינו הבאים, אנו transfect קו התא האנושי T עם HIV-Gag iGFP, ואנו משתמשים נגוע שכותרתו fluorescently CD4 + T תאים לשמש תאים יעד הנגיף. באמצעות תוויות ניאון שונה נוכל לעקוב בקלות ייצור התחבורה נגיפיים על פני מבנים אינטר שנקרא סינפסות virological. פשוט חדיר לתאי הגזים הדמיה מאפשרים לנו להתבונן סינפסות עם מיקרוסקופיה confocal לחיות דקות ימים. גישות אלה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר חלבונים נגיפיים, כאשר הם עוברים בתוך מתא אחד למשנהו.
Protocol
בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו הובנר ואח' המדע 323:. 1743-1747 (2009) .
1. סקירה
תא אל תא התפשטות של HIV תוארה לראשונה באמצעות תאים נגועים ב-HIV Jurkat כמו תאים התורם העיקרי CD4 + T לימפוציטים כמו תאים acceptor 1,2,3. במחקרים אלה, זוהה הנגיף בתאים קבוע באמצעות נוגדן מכתים. כדי לעקוב אחר העברה של הנגיף מתא לתא בתאים חיים, אנו מנצלים שיבוט רקומביננטי, מולקולרית זיהומיות של HIV נקרא HIV-Gag iGFP 4. היא נושאת את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מוכנס לתוך פנימי החלבון Gag בין תחומים MA ו-CA. זה שיבוט מולקולרי של HIV שומרת infectivity ללא צורך וירוס עוזר. חלקיקי הנגיף עשוי שיבוט זה נטענים stoichiometrically עם חלבון פלואורסצנטי ירוק, מתן אות הקרינה חזקה כדי לפקח על הרכבה העברת נגיפיים בין תאים. הפועל בשיתוף עם אינרטי התא מעקב צבעי ניאון, תאים הנמען יכול להיות מופלים מתאי התורם הזנה, המאפשר אחד כדי להמחיש את העברת HIV מתא T נגוע לתא T נגוע 5. היווצרות הסינפסה Virological והעברת נגיף מתא אחד לאחר מכן ניתן לצפות בתאים חיים בזמן שהם בתרבית חדר אטום, הדמיה גז חדיר.
(יום 1)
2. הכנה של HIV-Gag iGFP transfected Jurkat תאים T
- הכן את CD4 אנושי + T התא קו Jurkat (ATCC, Manassas, VA) על ידי בקפידה שמירה על תאים בריכוז שבין 2 x x 10 5 8 10 5 תאים / מ"ל Jurkat תרבות מדיה (RPMI 1640, 10% בסרום שור עוברית, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין). המפתח להצלחה: התרבות של תאים Jurkat בריכוזים עודף של 8 x 10 5 תאים / מ"ל תגרום להפחתת יעילות transfection.
הערה: transfection של ה-DNA-Gag iGFP HIV proviral לתאי T, כמתואר להלן, תוצאות בייצור של שכפול הנגיף-המוסמכת הכשל החיסוני האנושי. ככזה, נהלים כל להתבצע רק על ידי אנשי המעבדה הכשרה ברמה biosafety מוסמך 2 + או biosafety ברמה 3 (BL2 + / BL3) תרבות חדרים רקמות. עבודה עם HIV מדבקות מתקני הדמיה חייב להיות מאושר על ידי המשרד המקומי שלך biosafety מוסדיים. - Transfect Jurkats עם iGFP-Gag ויראלי פלסמיד, HIV בשיטת nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). גלולה 5 x 10 6 תאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 150 x ז לשאוב supernatant לשטוף את התאים פוספט סטרילי שנאגרו מלוחים (PBS). צנטריפוגה את התאים resuspend את הכדור אל μL של 97 V, טרום חימם פתרון nucleofector המכיל תוספת של היצרן. מוסיפים שלוש μL של רעלן פנימי חינם HIV-Gag iGFP פלסמיד (1 מיקרוגרם / μL) על השעיית התא ומערבבים בעדינות. מעבירים את ההשעיה התא קובט ו nucleofect באמצעות תוכנית ה-S-18. מיד להעביר את התאים מ"ל 3 של prewarmed תרבות התקשורת Jurkat ללא אנטיביוטיקה.
- כדי להכין CD4 + תאים יעד סינפסות virological, נקבל אדם בתאי הדם ההיקפיים mononuclear של באפי מעילים באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי Ficoll-Paque (GE Healthcare, אופסלה, שוודיה). תאים מסוג CD4 + T ואז הם נבחרו באופן שלילי באמצעות ערכת בידוד מגנטי חרוז (Miltenyi BIOTEC, אובורן, CA). אלה עשויים להיות מאוחסנים cryogenically ב N2 נוזלי aliquots 5 μL x 6 cells/500 10 של התקשורת הקפאה (90% עוברי DMSO serum/10% שור). CD4 העיקרי מופשר + T תאים בתרבית הם RPMI 10% FBS, בתוספת 10 יחידות / מ"ל של IL-2.
(יום 2)
3. שחזור של תאים חיים מ Jurkats transfected עם HIV-Gag iGFP ו מכתים של תאים היעד עם צבעי ניאון
- אפשר תאים Jurkat להתאושש transfection למשך הלילה. ואז להסיר את הפסולת התאית על ידי צנטריפוגה על חומר צפיפות hypaque ficoll הדרגתי. לוותר על 1.5 מ"ל של Ficoll-Paque לחלק התחתון של צינור חרוטי 15 מ"ל. בעדינות שכבת החומר הזה שיפוע עם Jurkats transfected בנפח 5 מ"ל של RPMI. צנטריפוגה התאים ב XG 400 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם משם. בזהירות להסיר את התאים באמצעות ממשק מדיה / Ficoll בעזרת פיפטה. העברת להם צינור חדש 15 מ"ל חרוטי. לדלל את התאים עם RMPI כדי בהיקף כולל של 15 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 300 עבור 10 דקות. Resuspend את הכדור בתוך 3 מ"ל של התקשורת Jurkat התרבות 2 ס"מ טוב (6-גם צלחת) ולהחזיר את התאים בתרבית רקמה חממה.
- כדי להבחין בין התאים היעד מתאי התורם בתא תאים ניסויים להעביר לנו prelabel CD4 + תאים היעד עם צבעי ניאון. ראשי CD4 + T תאים מסומנים גםing לפני השימוש. היו לנו מצוין תיוג הצלחה בתאי T עם CellTracker וגם צבעים CellTrace (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה). בעוד ריכוז צבע זמני דגירה חייב להיות מותאם בהתאם לצבע מסוים ואת סוג התא המשמש, פרוטוקול נציג להלן. גלולה 4 x 10 6 CD4 + T תאים ראשונית על ידי ספינינג ב XG 400 עבור 10 דקות. לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של PBS ו resuspend ב 2 מ"ל של PBS. הוסף CellTracker אורנג' (CMTMR, Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) לריכוז סופי של 1.5 מיקרומטר ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הוסף 8 מ"ל של התקשורת Jurkat מלאה צנטריפוגות ב XG 400 עבור 10 דקות. Resuspend התאים מ"ל 3 של מדיה מלאה בתוספת 10 יחידות / מ"ל של IL-2 ו - מקום לתרבות רקמות חממה לילה.
(יום 3)
4. ניטור סלולרי ל-תא העברה של HIV-Gag iGFP באמצעות הדמיה תא חי
אנו משתמשים באופן שגרתי HIV-Gag iGFP תאים Jurkat transfected 48 שעות שלאחר transfection. עם זאת, השתמשנו בהצלחה תאים מוקדם ככל 24 שעות, מאוחר ככל 72 שעות שלאחר transfection.
- כ 48 שעות שלאחר transfection, HIV-Gag iGFP Jurkats להביע נספרים, שטף עם CO 2-מדיה עצמאית (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה), ואת resuspended לחיות בתוך תא הדמיה התקשורת (CO 2 תקשורת עצמאית, 10% בסרום שור עוברית, 100 U / mL פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 10 יחידות / מ"ל IL-2) בריכוז של 1-3 x 10 7 תאים / מ"ל.
- באופן דומה, לרחוץ resuspend CD4 + יסודי שכותרתו בתאי T בריכוז של 1-3 x 10 7 תאים / מ"ל בתקשורת הדמיה תא חי.
- מערבבים HIV-Gag iGFP-transfected Jurkats עם CD4 + T תאים ראשונית ביחס 01:02 או 01:03 ו לטעון לתוך תרבות רקמות מטופלים, גז חדיר, microchamber (Ibidi, ורונה, WI). לדוגמה, שילוב 20 μL של HIV-Gag iGFP Jurkats transfected עם 40 μL של CD4 + יסודי שכותרתו ותאי T. טען 50 μL של תערובת זו לתוך תא Ibidi ולאטום את החדר עם אטמי. אבטח את אטמי ידי לפפה את התקע / ממשק Ibidi קאמרית עם parafilm.
5. שיקולים לפלטפורמות מיקרוסקופיה: ספינינג דיסק confocal הדמיה
לאחר טעינת תא הדמיה Ibidi עם תאים, אנחנו מיד לעלות את המכשיר על גבי מיקרוסקופ אופטי הפוכה (iX71 אולימפוס, מרכז עמק, הרשות הפלסטינית). החדר Ibidi יש להעביר המיקרוסקופ רק BL2 + מאומן אנשי המעבדה לובש בגדים בטיחות מתאימים. למרות לחיות תאים הדמיה כלל משתמשת בתאי הדגירה יקר כדי לשמור על יציבה 37 ° C סביבה, זה הושג באמצעות תנור התרמוסטט פשוט וחסכוני (אסי 400, Nevtek, Williamsville, VA) יחד עם טיפ תרמי מסוג T-רכוב ליד המדגם על המשוב הטמפרטורה הנכונה. מצאנו שימוש CO 2-מדיה עצמאית מאפשר לנו לשמור על כדאיות התא גבוהה תוך הימנעות משימוש חדר 2 CO. למאגר פלטפורמה נגד תנודות הטמפרטורה בחדר, כדי לחסום את האור בחדר רקע, גדול שחור תכריכים הוא תלוי על ההתקנה מיקרוסקופ / דוד שלמה ליצירת כיס אוויר מבודד סביב המערכת. זה מצמצם מאוד וריאציה הטמפרטורה להיסחף הקשורים בטמפרטורה הקשורות מדגם, אבל דורש מראש חימום במשך 30 דקות לפני הרכבה המדגם.
6. עיבוד נתונים, רכישת העברת תמונה
תמונות נלקחים באמצעות טבילה 60x 1.42 NA שמן אובייקטיבי (UPlanApo N, אולימפוס) כמו הצמצם המספרי גבוה (NA) משפר באופן משמעותי ברזולוציה. כדי ליצור תמונות 3D confocal, סריקה מבוצע על ידי יחידת דיסק ספינינג confocal (CSU-10, Yokagawa, יפן), כי בעת ובעונה אחת משתמשת> 800 הנקודות confocal כדי להגדיל באופן משמעותי את קצב הסריקה. כדי להחמיא המהירות שלו, את CSU-10 הוא זיווג עם מכשיר רגיש מאוד טעונה מצמידים אלקטרונים הכפלה (EMCCD, iXon + 897, אנדור טכנולוגיות, אירלנד) המצלמה כדי לאפשר הדמיה מהר, אור נמוך אשר מפחית הן photobleaching ו phototoxicity. מקור אור פלואורסצנטי הוא רב גל ArKr יון גז לייזר (Innova 70C, קוהרנטית, סנטה קלרה), שבה אורך הגל הרצוי (488 ננומטר) כוח לייזר למדוד ממש לפני המטרה מיקרוסקופ (<1 mW) נבחרים על ידי-acousto אופטיים מתכונן המסנן (AOTF), (אנדור טכנולוגיות). כדי לצמצם עוד יותר photobleaching ולהאריך את זמן הדמיה בסך הכל, AOTF במהירות (מיקרו) סוגר את קרן הלייזר בכל פעם שהמצלמה אינה פעילה (10-20 ms) בעוד תמונה החדשים שנרכשו מועבר מן CCD (15-30 חשיפה ms) למחשב. אור הלייזר מצמידים למערכת דיסק ספינינג באמצעות 405/488/568/647 מרובע הלהקה dichroic במראה (Semrock, רוצ'סטר, ניו יורק). פליטת הקרינה מסונן באמצעות מסנן bandpass 525/50 (Semrock) בתוך גלגל מסנן (מוצרים אלקטרוניים Ludl, הות'ורן, ניו יורק) עלה בetween המצלמה EMCCD ויחידת confocal דיסק מסתובב. חומרה כל ורכישה, לרבות Z-הבמה (Mad העיר Labs, מדיסון, ויסקונסין), נשלטים על ידי תוכנה IQ v1.8 אנדור. כדי למקסם את המהירות של רכישת בסביבות 1.2-1.9 ערימות second תמונה 3D, אנחנו לחתוך את האזור הקלטה של המצלמה של EMCCD מטה לאזור המיידי של התא זוג. יתר על כן, על חשבונו של מידע כלשהו ז"ל, גדול Z-צעד בין 0.45-0.75 מיקרומטר יכול לשמש כדי להאיץ את הרכישה. הדמיה בתנאים אלה יכול להימשך עד 6 שעות - שימוש רצוף קטעים 20-60 דקות - עם photobleaching מינימלית. בסך הכל, כל קטע נתונים בדרך כלל תופסת 5-20 GB של שטח כמו עשרות אלפי תמונות נלקחים. כדי להקל על התחבורה ניתוח של קובצי נתונים גדולים, כל קבוצה הרכישה צריך להיות מפורק וייצא כמו 1 GB קובץ TIFF מגזרים התמונה באמצעות אנדור IQ v1.8 תוכנה. מכאן, הרבה חבילות תוכנה מעולה זמינים עבור ניתוח התמונה, כגון Metamorph, Volocity ו ImageJ (אנו ממליצים וריאציה פיג'י שלה).
כאשר שני סמנים ניאון יש מעקב, אנחנו זמנית להקליט את שניהם מבלי להאט הרכישה באמצעות "מצב מסך מפוצל". הסמנים שניהם שמחים על ידי שני קווים שונים לייזר ArKr בבת אחת (בדרך כלל 488 ו - 568 ננומטר). מוזן ישירות לפני המצלמה EMCCD הוא דימוי ספליטר (OptoSplit השנייה, הגלעד, קנט, בריטניה) המפריד בין שתי תמונות שונות. תמונה כל כך מסוננים באופן עצמאי באמצעות מסנני הקרינה (Semrock) ו מוקרן Side-by-הצד על המצלמה בעת ובעונה אחת ליצור את "מסך מפוצל" אפקט. זה היה אז דורשים חיתוך ידני ושילוב של תמונות מאוחר יותר עיבוד תמונה.
7. שיקולים עבור עיבוד תמונה וניתוח נתונים
אנחנו בדרך כלל לבצע ניתוח התמונה עם Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) על מחשבי מקינטוש (אפל, Inc). ספינינג לייזר דיסק תמונות confocal מיקרוסקופיה מותאמים הראשון בעוצמה שלהם לתקן photobleaching, deconvolved אז עם Volocity. מדידות אינטנסיביות ומעקב אחר puncta Gag מבוצע עם מודול כימות Volocity. עבור ערכות תמונה שבה התנועה ביחס סינפסה מראש יצרו צריך להיות מחושב, אלגוריתם מעקב אוטומטי מועסק העוקב על הכפתור הסינפטי לאורך כל רצף. בדיקה ידנית של אזורים של עניין שהוגדר על ידי התוכנה autotracking חייב להתבצע על מנת לאשר כי התוכנה איתר נכונה את האובייקט הרצוי. עבור אובייקטים שבו בניגוד האובייקטים המקיפים חלשה מדי, מעקב ידני עשוי להתבצע על בסיס מסגרת לפי מסגרת. חבילת התוכנה מאפשרת Volocity הייצוא של מיקום XYZ, עוצמת אות משולב בתוך האובייקטים הרצויים. המרחק מן הסינפסה ומהירות של האובייקט מעקב מחושבים על ידי נרמול תנועות למרכז הכפתור הסינפטי.
8. נציג תוצאות
בתוך 10 עד 15 דקות של ערבוב אחד צריך להיות מסוגל לדמיין HIV-Gag iGFP תאים Jurkat להביע דבקות CD4 + T תאים העיקרי. הדמיה conjugates אלה, ניתן להעריך את תנועות puncta Gag בתאים נגועים וכן בתאים היעד לאחר synaspe. אפשר לראות את התנועה של puncta Gag-iGFP לתאי יעד קצר לאחר סינפסות נוצרות.
Discussion
אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לדמיין את ההעברה של HIV-מתא לתא. מחקרים אחרונים מהמעבדה שלנו ושל אחרים עולה כי זה עשוי להיות מצב השולט של HIV להתפשט בין ותאי T. השיטה המתוארת כאן מעסיקה צורה רקומביננטי של HIV, הנקרא HIV-Gag iGFP, אשר נושאת חלבון מקודד גנטית תג ירוק ניאון ב Gag מבניים הליבה, חלבון. בגלל רמות גבוהות של ה-GFP מיוצר כל חלקיק וירוס, זה שיבוט שכפול-המוסמכות של HIV מאפשר לחוקרים לעקוב אחר חלקיקי נגיף יחיד בזמן אמת. וירוס זה צריך להיות שימושי במיוחד במחקרים הנוגעים להעברת הרכבה תאים תאים של ה-HIV.
העברת ה-HIV על ידי העברת תאים התא היעילה ביותר. במהלך השעה שלוש שיתוף תרבות, אנו רואים שגרתי וירוס הועבר 20-30% של תאים T העיקרי להערכת cytometry הזרימה. יעילות דומה נראים איכותית במהלך ההדמיה תא חי. בתאי T שנדבק בנגיף להתחיל להרכיב סינפסות עם נגוע בתאי T העיקרי כמעט מיד לאחר תחילתו של תרבות משותפת. מעניין, לא כל התאים העיקריים T המסוגלים אינטראקציה עם HIV תאים הנגועים Jurkat למרות אינטראקציות בכפייה עם פינצטה לייזר (תצפיות פורסם, ג'נרל מוטורס). HIV-Gag iGFP יהיה ללא ספק להיות שימושי לקביעת תת תא T, כי הם רגישים ביותר להעביר תאים תאים, הן במבחנה in vivo.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
סקירה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים, AI074420-02, בורוז Wellcome פרס החוקר, המדען Hirschl קריירה פרסים BKC ועל ידי המרכז NSF עבור Biophotonics מדע וטכנולוגיה, הסכם שיתופית PHY012099, ועל מערכת הבריאות UCD מחקר פרס על TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jurkat T Cells | ATCC | ||
| Leukocyte buffy coats from whole blood | New York Blood Center | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich | ||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | ||
| Nucleofector System and Solution V | Lonza Inc. | ||
| EndoFree Maxi Prep Kits | Qiagen | ||
| HIV Gag-iGFP plasmid | Chen Laboratory | ||
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | ||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | ||
| Celltracker/CellTrace Dyes | Invitrogen | ||
| CO2-Independent Media | Invitrogen | ||
| Imaging Chambers | Ibidi | ||
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | Olympus Corporation | ||
| PlanApo N 1.42NA 60X oil objective | Olympus Corporation | ||
| Innova 70C ArKr ion gas laser | Coherent Inc. | ||
| CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit | Yokogawa | ||
| Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter | Semrock | ||
| 525/50 bandpass filter | Semrock | ||
| iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera | Andor | ||
| ASI 400 Thermostatic Heater | Nevtek |
References
- Blanco, J. High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells. J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).
- Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes. J Virol. 81, 1000-1012 (2007).
- Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse. J Exp Med. 199, 283-293 (2004).
- Hubner, W. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. J Virol. 81, 12596-12607 (2007).
- Hubner, W. Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses. Science. 323, 1743-1747 (2009).
