Summary
이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.
Abstract
융합 자신이 좋아하는 단백질에 녹색 형광 단백질로, 생물학 자 이제 형광 영상 현미경을 사용하여 복잡한 세포 프로세스를 살아있는 공부를하는 기능이 있습니다. 인간 면역 결핍 바이러스의 휴대 전화 전송하는 동안 인간 면역 결핍 바이러스 핵심 단백질의 움직임을 추적하려면, 우리는 HIV의 감염 분자 복제의 컨텍스트에서 개그 단백질, HIV 개그 - iGFP라는 GFP가 - 태그있다. 우리는 비디오 공촛점 현미경을 사용하여이 바이러스 복제를 공부합니다. 다음과 같은 시각 실험에서, 우리는 HIV 개그 - iGFP와 인간의 T 세포 라인을 transfect, 우리는 찬란 분류 감염되지 않은 CD4 + T 세포 바이러스에 대한 대상 세포 역할을 사용합니다. 우리가 쉽게 세포 구조를 통해 바이러스 생산과 운송에 따라 서로 다른 형광 라벨을 사용하면 virological 시냅스라고. 단순 가스 투과 이미징 챔버 스는 우리가 일 분 라이브 공촛점 현미경과 시냅스를 관찰할 수 있습니다. 이러한 방법들은 하나의 세포에서 다음에 이동 바이러스성 단백질을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
이 방법에 보고된 연구에 사용된 허브너 외 과학 323 :. 1743년에서 1747년까지 (2009)가 .
1. 개요
HIV의 휴대 전화의 전파는 원래 기증자 세포 및 기본 CD4 + 세포 수용체 1,2,3으로 T lymphocytes으로 HIV 감염 Jurkat 세포를 사용하여 설명했다. 이러한 연구에서 바이러스 항체 염색법을 사용하여 고정 세포에서 발견되었다. 라이브 세포에서 세포로 세포에서 바이러스의 전송을 추적하기 위해, 우리는 HIV 개그 - iGFP 4 불리는 HIV의 재조합, 전염성 분자 클론을 이용. 그것은 MA와 CA 도메인 사이의 개그 단백질에 내부 삽입 녹색 형광 단백질 (GFP)을 수행합니다. HIV의 분자 복제는 도우미 바이러스에 대한 필요없이 감염을 유지합니다. 이 클론으로 만든 바이러스 입자는 세포 사이 stoichiometrically 바이러스 조립 및 전송을 모니터 강한 형광 신호를 제공하는 녹색 형광 단백질과 함께로드됩니다. 와 함께 사용하면 불활성 셀 추적 형광 염료를받는 세포가 입력 기증자 세포에서 차별, 그리고 하나는 감염된 T 세포에서 감염되지 않은 T 세포 5 HIV의 전송을 시각화 수 있습니다. 그들은 밀봉, 가스 투과 이미징 챔버에서 양식하는 동안 Virological 버렸네 형성 한 세포에서 다른 바이러스의 전송은 다음 살아있는 세포에서 볼 수 있습니다.
(1 일)
2. HIV 개그 - iGFP의 준비 Jurkat T 세포를 Transfected
- 주의 2 X 10 5, 8 X 10 5 셀 / Jurkat 문화 미디어 (RPMI 1640 10 % 태아 소 혈청에서 ML 사이의 농도에서 세포를 유지하여 인간의 CD4 + T 세포 라인 Jurkat (ATCC, 머내서스, VA)을 준비, 100 단위 / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신). 성공에 열쇠 : 8 X 10 5 세포 / ML을 초과하는 농도의 Jurkat 세포의 문화 transfection 효율의 감소가 발생합니다.
참고 : 아래 설명 HIV 개그 - iGFP proviral DNA T 세포로, 복제 - 유능한 인간 면역 결핍 바이러스의 생산에 결과의 transfection. 따라서, 모든 절차는 인증 biosafety 레벨 2 + 또는 biosafety 레벨 3 (BL2 + / BL3) 조직 문화 룸에서만 교육 연구소 요원에 의해 실시되어야하는 것입니다. 영상 시설 전염성 HIV와 함께이 지역 기관 biosafety 사무소의 승인을 받아야합니다. - Amaxa의 nucleofection 방식 (Lonza, 워커스빌, MD)를 사용하여 바이러스 플라스미드, HIV의 개그 - iGFP로 Jurkats을 Transfect. 150 10 분 원심 분리하여 펠렛 5 X 10 6 세포 X G. 뜨는을 기음과 멸균 인산의 세포를 세차 호수 (PBS)를 버퍼. 세포를 원심과 제조 업체의 보충을 포함하는 미리 예열, nucleofector 솔루션 V 97 μL로 펠렛을 resuspend. 세포 현탁액에 플라스미드 내독소 무료 HIV 개그 - iGFP (1 μg / μL)의 세 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. 프로그램 S - 18을 사용하여 쿠베트과 nucleofect에 세포 현탁액을 전송합니다. 즉시 항생제없이 prewarmed Jurkat 문화 미디어 3 ML에 세포를 전송합니다.
- virological 시냅스에 대한 CD4 + 대상 세포를 준비하려면, 우리는 표준 Ficoll - Paque (GE 헬스케어, 웁살라, 스웨덴) 프로토콜을 사용하여 버피 외투에서 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포를 구하십시오. CD4 + T 세포는 다음 부정적인 자기 비드 절연 키트 (Miltenyi Biotec, 오번, CA)를 사용 선택됩니다. 이들은 저온 동결 미디어 5 X 10 6 cells/500 μL (90% 태아 소 serum/10 % DMSO)의 aliquots에서 액체 N2에 저장되어있을 수 있습니다. 해동 기본 CD4 + T 세포 10 대 / IL - 2의 ML과 보충 RPMI 10% FBS에 양식 있습니다.
(주 2)
3. HIV 개그 - iGFP와 형광 염료와 대상 세포의 스테 이닝과 Transfected Jurkats에서 생방송으로 세포의 복구
- Jurkat 세포는 밤새 transfection에서 복구할 수 있습니다. 그런 다음 ficoll의 hypaque 밀도 기울기 원심 분리를 통해 물질에 의해 세포 파편을 제거합니다. 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 Ficoll - Paque 1.5 ML 하는걸. 부드럽게 RPMI의 5 ML 볼륨에서 transfected Jurkats이 그라데이션 자료를 오버레이. 브레이크 해제와 함께 실온에서 20 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 피펫을 사용하여 미디어 / Ficoll 인터페이스에서 세포를 제거합니다. 새로운 15 ML 원뿔 관에게 전송합니다. 10 분 300 XG 15 ML 및 원심 분리기의 총 볼륨 RMPI로 세포를 희석. 잘 2cm (6 잘 플레이트)의 Jurkat 문화 미디어 3 ML에서 펠렛을 Resuspend과 조직 문화 인큐베이터로 세포를 반환합니다.
- 셀 - 셀 전송 실험에서 기증자 세포에서 대상 세포를 구분하기 위해 우리는 CD4를 prelabel + 형광 염료와 대상 세포를. 기본 CD4 + T 세포가도 표시 아르사용하기 전에 주입. 우리는 CellTracker 및 CellTrace의 염료 (Invitrogen, 칼스 배드, CA) 모두 훌륭한 성공 라벨 T 세포를 있었다. 염료 농도 및 배양 시간이 특정 염료 및 사용 세포 종류에 따라 최적화되어야합니다 있지만, 대표적인 프로토콜은 다음과 같습니다. 펠렛 4 X 10 6 주 CD4 + 10 분 400 XG의 회전에 의해 T 세포. PBS 2 ML의 PBS와 resuspend 5 ML있는 세포를 씻으십시오. 1.5 μm의의 최종 농도 CellTracker 오렌지 (CMTMR, Invitrogen, 칼스 배드, CA) 추가 37 20 분 ° C 품어. 전체 Jurkat 미디어 8 ML을 추가하고 10 분 400 XG에 원심 분리기. 10 대 / IL - 2의 ML과 하룻밤 조직 문화 인큐베이터의 장소 보충 전체 미디어 중 3 ML에있는 세포를 Resuspend.
(3 일)
4. 라이브 셀 이미징을 사용하여 HIV의 모니터링 휴대 전화 전송 재갈 - iGFP
우리는 일상적으로 HIV 개그 - iGFP transfected Jurkat 세포 48 시간 이후 transfection을 사용합니다. 그러나, 우리는 성공적으로 24시간 빠르면 세포를 사용하여 있고, 72시간 이후 transfection처럼 늦었어요.
- 약 48 시간 후 transfection, HIV 개그 - iGFP 표현 Jurkats는 CO와 씻은, 계산됩니다 2 독립 미디어 (Invitrogen, 칼스 배드, CA), 그리고 라이브 셀 이미징 미디어 (CO 2 독립 미디어 10 % 태아 소 혈청에서 resuspended 1-3 X 10 7 세포 / ML의 농도 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 10 단위 / ML IL - 2).
- 비슷한 방식으로, 씻고 1-3 X 10 7 셀 / 라이브 셀 이미징 미디어 ML의 농도에 표시된 기본 CD4 + T 세포를 resuspend.
- 기본 CD4 + 대우 조직 문화, 가스 투과, microchamber (Ibidi, 베로나, WI)에 1시 2분 또는 1시 3분 비율 및 부하에서 T 세포와 혼합 HIV는 개그 - iGFP - transfected Jurkats. 예를 들어, 레이블 주 CD4 + T 세포의 40 μL와 HIV 개그 - iGFP transfected Jurkats 20 μL를 섞는다. Ibidi 챔버에이 혼합물의 50 μL를로드하고 플러그와 챔버를 밀봉. parafilm와 플러그 / Ibidi 챔버 인터페이스를 배치하여 플러그를 고정합니다.
5. 현미경 플랫폼을위한 고려 사항 : 스피닝 디스크 공촛점 이미징
전지 Ibidi 이미징 챔버를 로딩 후에, 우리는 즉시 거꾸로 광학 현미경 (iX71 올림푸스, 센터 밸리, PA)에 장치를 탑재합니다. Ibidi 챔버는 적절한 안전 의상을 입고 BL2 + - 교육 실험실 요원에 의해 현미경을 전송해야합니다. 라이브 셀 이미징은 일반적으로 안정적인 37 ° C 환경을 유지하기 위해 고가의 배양 챔버 스를 사용하지만, 이것은 T - 타입 열전대 팁과 함께 간단하고 경제적인 온도 조절 히터를 (ASI 400 Nevtek, 윌리엄스빌, VA)를 사용하여 달성되었습니다 옆에 장착 적정 온도 피드백을위한 샘플. 우리는 2 - 독립 미디어가 CO 2 챔버의 사용을 피하고있는 동안 우리는 높은 세포 생존을 유지할 수있는 CO를 사용하여 찾을 수 있습니다. 방안에 온도 변화에 대한 플랫폼을 버퍼하고 배경 객실 조명을 차단하기 위해 큰 검은 장막이 시스템 주위에 절연 공기 주머니를 만들어 온 현미경 / 히터 설정을 통해 draped 있습니다. 이것은 크게 온도 변화와 관련 온도 관련 샘플 드리프트를 감소하지만, 사전에 샘플을 설치하기 위해 30 분 미리 가열이 필요합니다.
6. 데이터 수집, 전송 및 이미지 프로세싱
이미지는 높은 수치 조리개 (NA) 크게 해상도를 향상과 같은 60x 1.42 NA 오일 침지 목표 (UPlanApo N, 올림푸스)를 사용 찍은 있습니다. 3D 공촛점 이미지를 만들려면, 검사가 동시에 극적으로 검색 속도를 높일 수> 800 공촛점 장소를 사용하는 회전 디스크 공촛점 장치 (CSU - 10, Yokagawa, 일본)에 의해 수행됩니다. 의 속도, CSU - 10 photobleaching과 phototoxicity 모두 감소 빠르고, 낮은 조명 이미징 수 있도록 매우 민감한 전자 - 곱한 충전 - 결합 장치 (EMCCD, iXon + 897, Andor 기술, 아일랜드) 카메라에 대응됩니다. 경의를 표할 형광 광원이 선정하는 원하는 파장 (488 nm의)과 레이저의 파워는 바로 현미경 목표 (<1 MW)하기 전에 측정 멀티 파장 ArKr 이온 가스 레이저 (이노바 70C, 일관된, 산타 클라라)입니다 음향 광학 조정할 수있는 필터 (AOTF), (Andor 기술). 추가 photobleaching 절감 및 총 이미징 시간을 연장하기 위해 빠르게 AOTF은 (마이크로초) 레이저 빔을에게 새로 취득한 이미지가 CCD (15-30 MS 노출)에서 제공하는 동안 카메라 (10-20 MS) 비활성 때마다을 껐다 컴퓨터에. 레이저 빛은 405/488/568/647 쿼드 밴드 이색성 거울 (Semrock, 로체스터, NY)를 사용하여 회전 디스크 시스템에 결합됩니다. 형광 방출이 필터 휠 (Ludl 전자 제품, 호손, NY) 안에 50분의 525 대역 통과 필터 (Semrock)를 사용하여 필터링 장착 BEMCCD 카메라와 공촛점 회전 디스크 장치를 etween. Z - 스테이지 (매드시 연구소, 매디슨, WI)을 포함한 모든 하드웨어 및 인수는, Andor IQ v1.8 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 1.2-1.9 주위에 초 3D 이미지 스택에서 인수의 속도를 극대화하기 위해, 우리는 아래로 휴대 쌍의의 즉시 지역에 EMCCD의 카메라의 녹화 영역을 자르기. 또한, Z의 일부 정보의 비용으로, 0.45-0.75 μm의 사이에 큰 Z - 단계는 획득 속도를하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 영상은 6 시간까지 지속 - 지속적인 20-60 분의 세그먼트를 사용하여 - 최소한의 photobleaching과 함께. 모두 각 데이터 세그먼트는 일반적으로 이미지의 수만을 가져옵니다 같은 공간의 5-20 GB를 가득 메우고 있습니다. 대용량 데이터 파일의 전송 및 분석을 촉진하기 위해 각 인수 세트 세분화하고 Andor IQ v1.8 소프트웨어를 사용하여 1 GB TIFF 이미지 파일을 세그먼트로 내보낼 수 있어야합니다. 여기에서 많은 우수한 소프트웨어 패키지는 Metamorph, Volocity 및 ImageJ (우리는 변화 피지를 권장합니다)와 같은 이미지 분석을 위해 사용할 수 있습니다.
이 형광 마커가 추적해야하는 경우, 우리는 동시에 사용하여 인수를 늦추고없이 모두 기록 "분할 화면 모드를." 두 마커는 한 번에 두 개의 서로 다른 ArKr 레이저 라인 (보통 488와 568 nm의)에 의해 기쁘게 생각합니다. EMCCD 카메라가 두 개의 다른 이미지를 분리 이미지 스플리터 (OptoSplit II, 케언, 켄트, 영국)되기 전에 직접 삽입. 각각의 이미지가 독립적으로 한 번 '분할 화면'효과를 만드는 카메라에 형광 필터 (Semrock)와 예상되는 side - by - side를 사용하여 필터링됩니다. 이것은 다음 수동 자르기 이상의 이미지 프로세싱에서 이미지의 정렬을 필요로합니다.
7. 이미지 처리 및 데이터 분석을위한 고려 사항
우리는 일반적으로 매킨토시 컴퓨터에 Volocity (PerkinElmer, 월섬, MA) (애플, 병원)과 이미지 분석을 수행합니다. 스피닝 디스크 레이저 공촛점 현미경 이미지는 처음엔 Volocity와 deconvolved, photobleaching에 대해 올바른 자신의 강도 조정됩니다. 개그 puncta의 강도 측정 및 추적은 Volocity의 부량 모듈로 수행됩니다. 미리 구성된 버렸네에 상대적인 움직임이 계산해야 할 이미지 집합에 대한, 자동 추적 알고리즘은 전체 시퀀스에 걸쳐 신경 버튼을 추적하는 고용이다. autotracking 소프트웨어에 의해 정의된 관심 영역의 수동 검사는 소프트웨어가 올바르게 원하는 객체를 추적 것을 확인하기 위해 수행되어야합니다. 주변 물체와 대비가 너무 약한 객체에 대한 수동 추적 프레임으로 프레임 단위로 수행할 수 있습니다. Volocity 소프트웨어 패키지는 원하는 개체 내에서 XYZ 위치, 볼륨 및 통합 신호의 수출을 허용합니다. 추적할 개체의 버렸네과 속도에서 거리는 시냅스 단추의 중심에 움직임을 정규화하여 계산됩니다.
8. 대표 결과
혼합의 10 ~ 15 분 내에 하나는 기본 CD4을 준수하는 HIV 개그 - iGFP 표현 Jurkat 세포 + T 세포를 시각화 할 수 있어야합니다. 이미징 이러한 conjugates는 하나는 감염된 세포뿐 아니라 synaspe 후 대상 세포의 개그 puncta의 움직임을 평가할 수 있습니다. 시냅스가 형성되면 하나는 곧 대상 세포에 개그 - iGFP의 puncta의 움직임을 관찰 수 있습니다.
Discussion
우리는 여기서 세포 세포에서 HIV의 전송을 시각화를위한 간단한 방법을 설명합니다. 저희 연구실과 다른 '에서 최근 연구는이 T 세포 사이에 확산 HIV의 주된 모드있을 것입니다. 방법은 여기에 설명된 HIV의 재조합 형태를 채용, 핵심 구조 단백질, 개그의 유전자 인코딩 녹색 형광 단백질 태그를 실시 개그 - iGFP, HIV를했다. 때문에 각각의 바이러스 입자의 생산 GFP의 높은 수준, HIV의 복제 - 유능한 복제가 실시간으로 각각의 바이러스 입자를 추적하기 위해 연구자 수 있습니다. 이 바이러스는 HIV의 조립 및 셀 셀 전송에 관한 연구에 특히 유용합니다.
셀 - 셀 전송에 의해 HIV의 전송이 매우 효율적입니다. 3 시간 동안 공동의 문화, 우리가 일상이 유동세포계측법에 의해 평가와 같은 바이러스가 기본 T 세포의 20-30%로 전송을 참조하십시오. 비슷한 효율성은 질적 라이브 셀 이미징 동안 볼 수 있습니다. Virally 감염된 T 세포가 거의 즉시 공동 문화의 개시 이후에 감염되지 않은 기본 T 세포와 시냅스 형성을 시작합니다. 흥미, 모든 기본 T 세포가 레이저 핀셋 (게시되지 않은 관찰, GM)와 강제로 상호 작용에도 불구하고 HIV에 감염된 Jurkat 세포와 상호 작용이 가능합니다. HIV 개그 - iGFP은 의심의 여지없이 체외 및 생체내 세포 모두에서 세포 전송에 가장 민감한 T 세포 하위 집합을 결정하는 데 유용합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 검토는 건강 보조금 국립 연구소, AI074420 - 02, 버로우즈 웰컴의 탐정 수상, BKC에 Hirschl 경력 과학자 수상에 의해 및 Biophotonics 과학 기술에 대한 NSF 센터, 협동 계약 PHY012099, 그리고 TH에 UCD 보건 시스템 연구 수상에 의해 지원되었다 UCD CTSC NCRR ULRR024146.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jurkat T Cells | ATCC | ||
| Leukocyte buffy coats from whole blood | New York Blood Center | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich | ||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | ||
| Nucleofector System and Solution V | Lonza Inc. | ||
| EndoFree Maxi Prep Kits | Qiagen | ||
| HIV Gag-iGFP plasmid | Chen Laboratory | ||
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | ||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | ||
| Celltracker/CellTrace Dyes | Invitrogen | ||
| CO2-Independent Media | Invitrogen | ||
| Imaging Chambers | Ibidi | ||
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | Olympus Corporation | ||
| PlanApo N 1.42NA 60X oil objective | Olympus Corporation | ||
| Innova 70C ArKr ion gas laser | Coherent Inc. | ||
| CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit | Yokogawa | ||
| Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter | Semrock | ||
| 525/50 bandpass filter | Semrock | ||
| iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera | Andor | ||
| ASI 400 Thermostatic Heater | Nevtek |
References
- Blanco, J. High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells. J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).
- Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes. J Virol. 81, 1000-1012 (2007).
- Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse. J Exp Med. 199, 283-293 (2004).
- Hubner, W. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. J Virol. 81, 12596-12607 (2007).
- Hubner, W. Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses. Science. 323, 1743-1747 (2009).
