Summary
Это визуализируется эксперимент является руководством для использования флуоресцентных молекулярного клона ВИЧ для живых конфокальной экспериментов изображений.
Abstract
Соединяя зеленый флуоресцентный белок свою любимую белков, биологи теперь имеют возможность изучать жилого комплекса клеточных процессов с помощью флуоресцентной микроскопии видео. Для отслеживания движений иммунодефицита человека белкового ядра вирусом во время клетки к ячейке передачи вируса иммунодефицита человека, у нас есть GFP с метками Gag белка в контексте инфекционных молекулярного клона ВИЧ, называют ВИЧ-Gag iGFP. Мы изучаем этот вирусный клон с помощью видео конфокальной микроскопии. В следующем визуализированы эксперимента мы трансфекции человеческих Т-клеток линии с ВИЧ Gag-iGFP, и мы используем флуоресцентно меченных неинфицированных CD4 + Т-клеток в качестве клеток-мишеней для вируса. Использование различных флуоресцентных меток можно легко следить вирусного производства и транспорта через межклеточные структуры, называемые вирусологический синапс. Простые газопроницаемых изображения камеры позволяют нам наблюдать синапсы с живой конфокальной микроскопии от нескольких минут до нескольких дней. Эти подходы могут быть использованы для отслеживания вирусных белков при их движении в от одной клетки к другой.
Protocol
Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Хюбнер и др. Наука 323:. 1743-1747 (2009) .
1. Обзор
Сотовые к клетке распространения ВИЧ-инфекции была первоначально описана с использованием ВИЧ-инфицированных клеток Jurkat в качестве донорских клеток и первичных CD4 + Т-лимфоциты, клетки акцептором 1,2,3. В этих исследованиях вирус был обнаружен в фиксированных ячеек с помощью антител окрашивания. Для отслеживания передачи вируса от клетки к клетке в живых клетках, мы используем рекомбинантный, инфекционные молекулярного клона ВИЧ называется ВИЧ Gag-iGFP 4. Она несет зеленый флуоресцентный белок (GFP), вставленную в внутренне Gag белка между М. и К. доменов. Этот молекулярный клон ВИЧ сохраняет инфекционность без необходимости использования вспомогательных вируса. Вирусные частицы из этого клона являются стехиометрически загружены зеленый флуоресцентный белок, обеспечивающий сильный сигнал флуоресценции для контроля вирусной сборки и передачу между клетками. При использовании в сочетании с инертным клеточной отслеживания флуоресцентные красители, клетки-реципиенты могут подвергаться дискриминации из ячейки ввода донора, и позволяющая визуализировать передачи ВИЧ от инфицированных Т-клеток в неинфицированных Т-клеток 5. Вирусологические образование синапсов и передача вируса от одной клетки к другой можно наблюдать в живых клетках, пока они культивируют в запечатанных, газопроницаемых камеры изображений.
(День 1)
2. Подготовка ВИЧ Gag-iGFP трансфицированных Jurkat Т-клетки
- Подготовка человеческих CD4 + T-клеточной линии Jurkat (АТСС, Манассас, Вирджиния), тщательно поддержание клеток в концентрации от 2 х 10 5 и 8 х 10 5 клеток / мл в Jurkat питательные среды (RPMI 1640 году, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина). Ключ к успеху: Культура Jurkat клеток в концентрациях, превышающих 8 х 10 5 клеток / мл приводит к снижению эффективности трансфекции.
Примечание: трансфекции ВИЧ Gag-iGFP провирусной ДНК в Т-клетки, как описано ниже, приводит к производству репликации компетентным вирусом иммунодефицита человека. Таким образом, все процедуры, которые будут осуществляться только обученным персоналом лаборатории в сертифицированных уровня биобезопасности 2 + или 3-го уровня биобезопасности (BL2 + / BL3) номеров тканевой культуры. Работа с инфекционными ВИЧ в учреждениях, изображения должны быть одобрены ваши местные институциональные офиса биобезопасности. - Трансфекции Jurkats с вирусной плазмиды, ВИЧ Gag-iGFP методом Amaxa nucleofection (Lonza, Уолкерсвилл, MD). Пеллет 5 х 10 6 клеток центрифугированием в течение 10 мин при 150 х г. Аспирируйте супернатант и мыть клеток в стерильных фосфатным буферным раствором (PBS). Центрифуга клетки и ресуспендируют осадок до 97 мкл предварительно нагревают, nucleofector В раствор, содержащий дополнения производителя. Добавьте три мкл эндотоксина свободной ВИЧ Gag-iGFP плазмиды (1 мкг / мкл) в клеточной суспензии и аккуратно перемешать. Передача клеточной суспензии в кювет и nucleofect с помощью программы S-18. Сразу передачи клетки до 3 мл нагретого Jurkat питательных сред без антибиотиков.
- Для подготовки CD4 + клеток-мишеней для вирусологического синапсов, мы получаем человека мононуклеарных клеток периферической крови от Баффи пальто с помощью стандартных Ficoll-Paque (GE Healthcare, Упсала, Швеция) протоколу. CD4 + Т-клеток, которые затем негативно выбираются с помощью магнитного шарик комплект изоляции (Miltenyi Biotec, Оберн, Калифорния). Они могут быть криогенно хранится в жидком N2 в аликвоты 5 х 10 6 cells/500 мкл замораживания средств массовой информации (90% эмбриональной телячьей serum/10% ДМСО). Талая первичных CD4 + T-клетки культивируют в RPMI 10% FBS, с добавлением 10 ЕД / мл ИЛ-2.
(День 2)
3. Восстановление живой клетки из Jurkats трансфицированных с ВИЧ Gag-iGFP и окрашивания клеток-мишеней с флуоресцентными красителями
- Разрешить Jurkat клеткам восстановиться после трансфекции в одночасье. Затем удалите распада клеток путем центрифугирования на плотность материала Ficoll градиент гипак. Внесите 1,5 мл Ficoll-Paque на дно 15 мл коническую трубку. Аккуратно наложения этот градиент материала с трансфицированных Jurkats в 5 мл объема RPMI. Центрифуга клетки при 400 мкг в течение 20 мин при комнатной температуре с вынул. Осторожно удалите клетки из средств массовой информации / Ficoll интерфейс с помощью пипетки. Передача их в новый 15 мл коническую трубку. Развести клеток с RMPI к общим объемом 15 мл и центрифуге при 300 мкг в течение 10 мин. Ресуспендируют гранул в 3 мл СМИ Jurkat культуры в 2 см и (6-луночный планшет) и вернуть клетки культуры ткани инкубатора.
- Чтобы отличать клетки-мишени из донорских клеток в межклеточной передаче экспериментов мы prelabel CD4 + клеток-мишеней с флуоресцентными красителями. Первичная CD4 + Т-клетки помечены дажеING перед использованием. У нас были отличные успехи маркировка Т-клеток с обеих CellTracker и CellTrace красителей (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). В то время как концентрации красителя и времени инкубации должны быть оптимизированы в зависимости от конкретного красителя и типа клеток используются, представитель протокол следующим образом. Пеллет 4 х 10 6 первичных CD4 + Т-клеток, крутя при 400 мкг в течение 10 мин. Вымойте клеток с 5 мл PBS и ресуспендируют в 2 мл PBS. Добавить CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) до конечной концентрации 1,5 мкМ и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 20 мин. Добавить 8 мл полной среды Jurkat и центрифуге при 400 мкг в течение 10 мин. Ресуспендируют клетки в 3 мл полной среды с добавлением 10 ЕД / мл ИЛ-2 и место в культуре ткани инкубаторе на ночь.
(День 3)
4. Мониторинг сотовый к клетке Передача ВИЧ Gag-iGFP использованием живого изображения сотовый
Мы обычно используют ВИЧ Gag-iGFP трансфицированных клеток Jurkat 48 часов после трансфекции. Тем не менее, мы успешно использовали клетки уже в 24 часов, и, как в конце 72 часа после трансфекции.
- Около 48 часов после трансфекции, ВИЧ Gag-iGFP выражения Jurkats подсчитывают, промывают CO 2-независимые средства массовой информации (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), и ресуспендировали в живой клетке изображений СМИ (CO 2 независимых средств массовой информации, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ЕД / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, 10 ед / мл ИЛ-2) в концентрации 1-3 х 10 7 клеток / мл.
- Подобным же образом, вымыть и ресуспендирования помечены первичных CD4 + Т-клеток в концентрации 1-3 х 10 7 клеток / мл в живых СМИ изображений клеток.
- Смешайте ВИЧ Gag-iGFP-трансфекции с первичными Jurkats CD4 + Т-клеток на 1:2 или 1:3 отношение и загрузить в культуре ткани лечится, газопроницаемых, микрокамере (Ibidi, Верона, Висконсин). Например, смешайте 20 мкл ВИЧ Gag-iGFP трансфицированных Jurkats с 40 мкл меченых первичных CD4 + Т-клеток. Нагрузка 50 мкл этой смеси в камере Ibidi и печатью камера с пробками. Безопасные пробки, обернув плагин / Ibidi камеры с интерфейсом парафильмом.
5. Вопросы микроскопии платформ: вращающийся диск конфокальной микроскопии
После загрузки камеры Ibidi изображений с клетками, мы сразу же крепление устройства на перевернутый оптический микроскоп (Olympus iX71, Center Valley, PA). Камера Ibidi должны быть переданы в микроскоп только BL2 +-обучение персонала лабораторий носить соответствующую одежду безопасности. Хотя жить-клеточного изображения обычно использует дорогие камеры инкубации для поддержания стабильной температуре 37 ° C окружающей среды, это было достигнуто с помощью простой и экономичный термостатический нагреватель (ASI 400, Nevtek, Williamsville, В. А.), наряду с Т-тип наконечника термопары установлен рядом с образец для правильной обратной температуры. Мы должны найти с помощью СО 2-независимые средства массовой информации позволяет нам поддерживать высокую жизнеспособность клеток, избегая при этом использования CO 2 камеры. Для буферизации платформы от колебаний температуры в комнате, и, чтобы блокировать светлом фоне комнаты, большой черный саван накинутой целом микроскопом / обогреватель установки создания изолированных воздушный карман по всей системе. Это значительно уменьшает изменение температуры и связанные с ними связанных с температурой образца дрейф, но требует предварительного прогрева в течение 30 минут до установки образца.
6. Сбора данных, передачи и обработки изображений
Изображения, сделанные с использованием 60x 1,42 NA нефти погружения цели (UPlanApo N, Olympus), а высокий числовой апертурой (NA) значительно улучшает разрешение. Для создания 3D конфокальных изображений, сканирование производится с помощью вращающегося диска конфокальной единицы (CSU-10, Yokagawa, Япония), который одновременно использует> 800 конфокальной пятна, чтобы существенно увеличить скорость сканирования. Чтобы комплимент ее скорость, CSU-10 в паре с высокочувствительными электронно-умножения с зарядовой связью устройства (EMCCD, IXON + 897, Андор технологий, Ирландия) камеры позволяют быстро, низко изображения света, который снижает как фотообесцвечивания и фототоксичности. Флуоресценции источник света на волнах разной длины ArKr ионных газовых лазеров (Innova 70C, когерентного, Санта-Клара), где желаемой длины волны (488 нм) и мощности лазерного излучения измеряется непосредственно перед объектива микроскопа (<1 мВт) выбираются акусто- оптические перестраиваемый фильтр (AOTF), (Андор технологий). В целях дальнейшего сокращения фотообесцвечивания и продлить общее время обработки изображений, AOTF быстро (микросекунды) отключает лазерный луч каждый раз, когда камера неактивна (10-20 мс), в то время как недавно полученное изображение передается от CCD (15-30 мс экспозиции) к компьютеру. Лазерного света вводится в система раскрутки диска с помощью 405/488/568/647 Quad Band дихроичных зеркала (Semrock, Рочестер, штат Нью-Йорк). Флуоресценция выбросов фильтруется с помощью 525/50 полосовой фильтр (Semrock) внутри фильтра колесо (Ludl электронные продукты, Хоторн, Нью-Йорк), установленных бetween EMCCD камеры и конфокальной вращающийся диск устройства. Все аппаратные и приобретения, в том числе г-стадии (Безумный город Labs, Мэдисон, Висконсин), находятся под контролем Андор IQ v1.8 программного обеспечения. Для достижения максимальной скорости приобретения в пределах 1,2-1,9 второго 3D-стеков изображение, мы урожай записи область камеры EMCCD вниз к непосредственной области клеточной пары. Кроме того, за счет некоторой информации от г, больших г-шаг между 0.45-0.75 мкм могут быть использованы для ускорения приобретения. Изображений в этих условиях может длиться до 6 часов - с использованием непрерывного минуту 20-60 сегментах - с минимальным фотообесцвечивания. В общей сложности каждый сегмент данных обычно занимает 5-20 Гб пространства, как десятки тысяч изображения взяты. Чтобы облегчить транспортировку и анализ больших файлов данных, каждое приобретение набора должна быть разбита и экспортировать как 1 Гб файл изображения TIFF сегментов с помощью Андор IQ v1.8 программного обеспечения. Отсюда много прекрасных пакетов программного обеспечения для анализа изображений, таких как Метаморф, Volocity и ImageJ (мы рекомендуем ее изменение Фиджи).
Когда две флуоресцентные маркеры, которые необходимо отслеживать, мы одновременно записывать их обоих, не замедляя приобретения с помощью "оконный режим". Оба маркеры возбуждаются два разных ArKr лазерные линии одновременно (часто 488 и 568 нм). Извините, непосредственно перед EMCCD камеры изображение разветвитель (OptoSplit II, Керн, графство Кент, Великобритания), которая отделяет два разных изображения. Каждое изображение затем самостоятельно фильтруется с помощью флуоресцентной фильтры (Semrock) и ожидаемое бок о бок на камеры сразу создания "разделенного экрана» эффект. Это было бы то требуют ручной обрезки и выравнивания изображений позже в обработке изображений.
7. Вопросы обработки изображений и анализа данных
Мы обычно выполняют анализ изображений с Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) на компьютерах Macintosh (Apple, Inc). Вращающийся диск лазерной конфокальной микроскопии изображений сначала корректируются в их интенсивности для коррекции фотообесцвечивания, то deconvolved с Volocity. Интенсивность измерения и отслеживания Gag puncta осуществляется с помощью модуля Количественное Volocity. Для изображения множества, где движение по отношению к предварительно сформированных синапса должна быть рассчитана, автоматизированных алгоритм отслеживания используется, которая отслеживает синаптических кнопку на всей последовательности. Руководство проверки регионов интерес определяется автоматическое сопровождение программного обеспечения должны быть выполнены, чтобы подтвердить, что программное обеспечение правильно гусеничных нужного объекта. Для объектов, где контраст с окружающими предметами слишком слаб, ручного отслеживания могут быть выполнены на кадр за кадром. Пакет программного обеспечения позволяет Volocity экспорт XYZ место, объем и интегрированных сигнала в нужные объекты. Расстояние от синапса и скорости отслеживаемые объектов рассчитываются по нормализации движения к центру синаптических кнопку.
8. Представитель Результаты
В течение 10 до 15 минут после смешивания один должен быть в состоянии представить себе ВИЧ Gag-iGFP выражения Jurkat клетки придерживаясь основной CD4 + Т-клеток. Изображениями этих конъюгатов, можно оценить движение Gag puncta в инфицированных клетках, а также в клетках-мишенях после synaspe. Можно наблюдать движение Gag-iGFP puncta в клетки-мишени сразу после синапсы формируются.
Discussion
Мы описываем здесь простой метод визуализации передачи ВИЧ от клетки-ячейки. Недавние исследования в нашей лаборатории и других показывают, что это может быть основным путем распространения ВИЧ-инфекции между Т-клеток. Метод, описанный здесь работают рекомбинантная форма ВИЧ, называют ВИЧ-Gag iGFP, который несет генетически закодированы зеленого флуоресцентного белка в теге основной структурный белок, Gag. Из-за высокого уровня GFP производится в каждой вирусной частицы, эта репликации компетентных клон ВИЧ позволяет исследователям отслеживать отдельные частицы вируса в реальном времени. Этот вирус должен быть особенно полезны в исследованиях, касающихся сборки и межклеточной передачи ВИЧ-инфекции.
Передача ВИЧ от межклеточной передачи высокую эффективность. Во время трехчасовой совместно культуры, мы видим обычный вирус передается 20-30% первичных Т-клеток, по оценке проточной цитометрии. Подобные эффективности качественно видели во время живого изображения клетки. Инфицированных вирусом Т-клетки начинают формироваться синапсы с неинфицированных первичных Т-клетки практически сразу после начала совместной культуры. Интересно, не все первичные Т-клетки способны взаимодействовать с ВИЧ-инфицированные клетки Jurkat, несмотря на принудительное взаимодействия с лазерным пинцетом (неопубликованные наблюдения, GM). Gag ВИЧ-iGFP, несомненно, будут полезны для определения подмножества T ячейки, которые наиболее восприимчивы к межклеточной передачи, как в пробирке и в естественных условиях.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Этот обзор был поддержан Национальным институтом здоровья гранты, AI074420-02, Burroughs Wellcome Следователь премии, Hirschl Карьера ученого награждении BKC и NSF Центр биофотоники науки и техники, соглашение о сотрудничестве PHY012099 и системы UCD исследованиям в области здравоохранения премию TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jurkat T Cells | ATCC | ||
| Leukocyte buffy coats from whole blood | New York Blood Center | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich | ||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | ||
| Nucleofector System and Solution V | Lonza Inc. | ||
| EndoFree Maxi Prep Kits | Qiagen | ||
| HIV Gag-iGFP plasmid | Chen Laboratory | ||
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | ||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | ||
| Celltracker/CellTrace Dyes | Invitrogen | ||
| CO2-Independent Media | Invitrogen | ||
| Imaging Chambers | Ibidi | ||
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | Olympus Corporation | ||
| PlanApo N 1.42NA 60X oil objective | Olympus Corporation | ||
| Innova 70C ArKr ion gas laser | Coherent Inc. | ||
| CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit | Yokogawa | ||
| Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter | Semrock | ||
| 525/50 bandpass filter | Semrock | ||
| iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera | Andor | ||
| ASI 400 Thermostatic Heater | Nevtek |
References
- Blanco, J. High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells. J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).
- Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes. J Virol. 81, 1000-1012 (2007).
- Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse. J Exp Med. 199, 283-293 (2004).
- Hubner, W. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. J Virol. 81, 12596-12607 (2007).
- Hubner, W. Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses. Science. 323, 1743-1747 (2009).
