Summary
Este experimento visualizado es una guía para la utilización de un clon de fluorescencia molecular del VIH para vivir experimentos de imagen confocal.
Abstract
Mediante la fusión de la proteína verde fluorescente a las proteínas de su favorito, los biólogos tienen ahora la posibilidad de estudiar vivos complejos procesos celulares mediante microscopía de fluorescencia de vídeo. Para seguir los movimientos de la inmunodeficiencia humana proteína central del virus en la célula a célula de transmisión del virus de inmunodeficiencia humana, tenemos buenas prácticas agrarias de etiquetado de la proteína Gag en el contexto de un clon infeccioso molecular del VIH, llamada Gag del VIH-iGFP. Estudiamos este clon viral mediante microscopía confocal de vídeo. En el experimento visualizado siguiente, transfectar una línea humana de células T por el VIH Gag-iGFP, y usamos la etiqueta fluorescente CD4 + en las células no infectadas T como las células diana para el virus. Utilizando las diferentes etiquetas fluorescentes se pueden seguir fácilmente la producción viral y el transporte intercelular a través de estructuras llamadas sinapsis virológicas. Simples cámaras de gas permeable imágenes nos permiten observar con el microscopio de las sinapsis en vivo confocal de minutos a días. Estos métodos pueden ser utilizados para rastrear proteínas víricas a medida que avanzan en la de una célula a otra.
Protocol
Este método se utilizó en la investigación publicada en ciencia Hübner et al 323:. 1743 hasta 1747 (2009) .
1. Información general
De célula a célula propagación del VIH fue descrito utilizando células infectadas por el VIH Jurkat como donantes de células CD4 y primaria de los linfocitos T como las células aceptor 1,2,3. En estos estudios, se detectó el virus en las células fijadas mediante la tinción de anticuerpos. Para realizar el seguimiento de la transferencia de virus de célula a célula en las células vivas, que explotan un clon recombinante, infecciosos molecular del VIH, llamada Gag del VIH-iGFP 4. Lleva la proteína verde fluorescente (GFP) que se inserta en el interior de la proteína Gag entre los dominios de MA y CA. Este clon molecular del VIH mantiene infectividad, sin necesidad de virus ayudante. Las partículas de virus a partir de este clon se estequiométricamente cargado con la proteína fluorescente verde, que proporciona una señal fuerte de fluorescencia de supervisar montaje viral y la transferencia entre las células. Cuando se utiliza junto con un material inerte de células de seguimiento de los tintes fluorescentes, las células receptoras pueden ser discriminados a partir de células de donantes de entrada, y permitiendo a visualizar la Transmisión del VIH de una célula T infectada a una de las células T infectadas 5. La formación de sinapsis virológicas y la transferencia de virus a partir de una célula a otra puede ser observado en las células vivas, mientras que se cultivan en un sobre cerrado, permeables a los gases de cámara de imagen.
(Día 1)
2. Preparación del VIH Gag-iGFP transfectadas las células Jurkat T
- Preparar el CD4 + T línea celular Jurkat (ATCC, Manassas, VA) con cuidado el mantenimiento de las células a una concentración entre 2 x x 10 5 y 8 10 5 células / ml en Jurkat medios de cultivo (RPMI 1640, 10% de suero fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina y 100 mg / mL). La clave del éxito: la cultura de las células Jurkat en concentraciones de más de 8 x 10 5 células / ml se traducirá en una reducción en la eficiencia de transfección.
Nota: La transfección de VIH Gag-iGFP ADN proviral en las células T, como se describe a continuación, los resultados en la producción de un competente para la replicación del virus de inmunodeficiencia humana. Por lo tanto, todos los procedimientos deben ser realizados únicamente por personal calificado de laboratorio en función del nivel de bioseguridad 2 + o de bioseguridad de nivel 3 (BL2 + / BL3) salas de cultivo de tejidos. Trabajar con el VIH infeccioso en los centros de formación de imágenes deben ser aprobados por la oficina local institucional de bioseguridad. - Transfectar las Jurkats con el plásmido viral, VIH Gag-iGFP utilizando el método de nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 células por centrifugación durante 10 minutos a 150 x g. Aspirar el sobrenadante y lavar las células en solución salina estéril tamponada de fosfato (PBS). Centrifugar las células y resuspender el precipitado a 97 l de pre-calentado, V nucleofector solución que contiene suplemento del fabricante. Agregue tres L de endotoxinas VIH Gag-iGFP plásmido (1 mg / l) a la suspensión celular y mezclar suavemente. La transferencia de la suspensión celular a una cubeta y nucleofect mediante el programa S-18. Inmediatamente la transferencia de las células a 3 ml de los medios de comunicación precalentado Jurkat cultura sin antibióticos.
- Para preparar las células CD4 + objetivo de las sinapsis virológicas, se obtienen las células mononucleares de sangre periférica buffy abrigos mediante el uso de un estándar de Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) de protocolo. Células T CD4 + son entonces seleccionados negativamente con un kit de aislamiento magnético de grano (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Estos pueden ser criogénicamente almacenaron en N2 líquido en alícuotas de 5 x 10 6 células/500 l de los medios de congelación (90% fetal bovino serum/10% DMSO). Descongelado CD4 + células T primarias son cultivadas en RPMI 10% FBS, suplementado con 10 unidades / ml de IL-2.
(Día 2)
3. La recuperación de células vivas de Jurkats transfectadas con el VIH Gag-iGFP y tinción de las células diana con tintes fluorescentes
- Permitir que las células Jurkat a recuperarse de la noche a la mañana transfección. A continuación, retire los restos celulares por centrifugación en un material de Ficoll Hypaque gradiente de densidad. Prescindir de 1,5 ml de Ficoll-Paque de la parte inferior de un tubo cónico de 15 ml. Suavemente superposición de este material con el gradiente de Jurkats transfectadas en un volumen de 5 ml de RPMI. Centrifugar las células a 400 xg durante 20 min a temperatura ambiente con el freno de apagado. Retire con cuidado las células de la interfaz de los medios de comunicación / Ficoll con una pipeta. Transferirlos a un nuevo tubo de 15 mL cónico. Diluir las células con RMPI a un volumen total de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Resuspender el sedimento en 3 ml de medio de cultivo Jurkat en 2 cm y (6 y placa) y el retorno de las células en el tejido incubadora de cultivo.
- Para distinguir las células diana de las células del donante en experimentos de transferencia de célula a célula que prelabel las células CD4 + blanco con tintes fluorescentes. CD4 + en las células T primarias están etiquetados, incluso lación antes de su uso. Hemos tenido un excelente éxito de etiquetado células T con las dos CellTracker y tintes CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mientras que la concentración de colorante y los tiempos de incubación debe ser optimizado en función del medio de contraste y tipo de células empleadas, un protocolo de representante de los siguientes. Pellet 4 x 10 6 células CD4 + T cells principal girando a 400 xg durante 10 min. Se lavan las células con 5 ml de PBS y resuspender en 2 ml de PBS. Añadir CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) a una concentración final de 1,5 M y se incuba a 37 ° C durante 20 min. Añadir 8 ml de los medios de comunicación Jurkat completa y centrifugar a 400 xg durante 10 min. Resuspender las células en 3 ml de medio completo suplementado con 10 unidades / ml de IL-2 y el lugar en el cultivo de tejidos incubadora durante la noche.
(Día 3)
4. Monitoreo de la célula a célula de Transmisión del VIH Gag-iGFP utilizando imágenes de células vivas
Nosotros usamos el VIH iGFP Gag-las células Jurkat transfectadas 48 horas después de la transfección. Sin embargo, hemos utilizado con éxito células a las 24 horas, y tan tarde como 72 horas después de la transfección.
- Aproximadamente 48 horas después de la transfección, el VIH iGFP Gag-Jurkats expresa se cuentan, se lava con CO 2-medios de comunicación independientes (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se resuspendió en células vivas imágenes de los medios de comunicación (CO 2 medios de comunicación independientes, el 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina y 100 mg / ml, 10 unidades / mL de IL-2) a una concentración de 3.1 x 10 7 células / ml.
- De manera similar, lavar y volver a suspender la etiqueta principal CD4 + células T en una concentración de 1.3 x 10 7 células / ml en los medios de comunicación en vivo de células de imagen.
- Mezclar el VIH Gag-iGFP transfectadas con CD4 Jurkats primaria + células T en una proporción de 1:2 o 1:3 y de carga en un cultivo de tejidos tratados, permeables al gas, microcámara (ibidi, Verona, WI). Por ejemplo, mezcla de 20 l de VIH iGFP Gag-Jurkats transfectadas con 40 l de la etiqueta principal CD4 + T cells. Carga de 50 l de esta mezcla en una cámara de ibidi y sellar la cámara con tapones. Asegurar los tapones, envolviendo el cable / interface ibidi cámara con parafilm.
5. Consideraciones para las plataformas de microscopía: spinning disco microscopía confocal
Después de cargar una cámara de imágenes ibidi con las células, inmediatamente montar el dispositivo en un microscopio invertido óptico (Olympus IX71, Center Valley, PA). La cámara de ibidi deben ser transferidos al microscopio sólo por personal de laboratorio BL2 +-experto provisto de prendas de seguridad adecuadas. A pesar de células vivas, imágenes comúnmente utiliza cámaras de incubación cara a mantener la estabilidad del medio ambiente 37 º C, esto se logró mediante un calentador termostático sencilla y económica (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA), junto con una punta de tipo T termopar montado al lado de la muestra de retroalimentación temperatura adecuada. Hemos encontrado el uso de CO 2-medios de comunicación independientes que nos permite mantener la viabilidad celular alta, evitando el uso de una cámara de CO 2. Para amortiguar la plataforma contra las fluctuaciones de temperatura en la habitación y para bloquear la luz fondo de la sala, un gran velo negro se monta sobre el conjunto microscopio / calentador de configuración de la creación de una bolsa de aire con aislamiento de todo el sistema. Esto reduce en gran medida las variaciones de temperatura y asociados relacionados con la temperatura de la muestra la deriva, sino que requiere de pre-calentamiento durante 30 minutos antes de montar la muestra.
6. Adquisición de Datos, transferencia y procesamiento de imágenes
Las imágenes se tomaron usando un aceite de 60x 1.42 NA objetivo de inmersión (UPlanApo N, Olympus), como la apertura numérica (NA) mejora notablemente la resolución. Para crear imágenes en 3D confocal, la exploración se realiza por una unidad de disco giratorio confocal (CSU-10, Yokagawa, Japón) que a la vez utiliza> 800 puntos confocal para aumentar drásticamente la velocidad de barrido. Para complementar su velocidad, la CSU-10 se combina con una alta sensibilidad de electrones multiplicando acusado dispositivo de acoplamiento (EMCCD, ixon + 897, Tecnologías de Andor, Irlanda) para permitir que la cámara de imagen rápido, con poca luz que reduce tanto photobleaching y fototoxicidad. La fuente de luz de fluorescencia es un multi-longitud de onda ArKr iones de gas láser (Innova 70C, coherente, Santa Clara), donde la longitud de onda deseada (488 nm) y la potencia del láser mide justo antes de que el objetivo del microscopio (<1 mW) son seleccionados por un acústico- óptica filtro sintonizable (AOTF), (Tecnologías de Andor). Para reducir aún más photobleaching y extender el tiempo de imagen total, el AOTF rápidamente (microsegundos) corta el rayo láser cada vez que la cámara está inactiva (10-20 ms), mientras que la imagen recién adquirida se entrega desde el CCD (15-30 ms de exposición) a la computadora. La luz del láser se acopla al sistema de disco giratorio con un cuádruple banda 405/488/568/647 espejo dicroico (Semrock, Rochester, NY). Emisión de fluorescencia se filtra utilizando un filtro de banda 525/50 (Semrock) dentro de una rueda de filtros (Ludl productos electrónicos, Hawthorne, NY) montado bntre la cámara EMCCD y la unidad de giro del disco confocal. Todo el hardware y la adquisición, incluyendo un z-etapa (Mad Laboratorios City, Madison, WI), están controlados por el iQ Andor v1.8 software. Para maximizar la velocidad de adquisición de alrededor de 1,2 a 1,9 segundos montones de imágenes en 3D, que los cultivos de la región de grabación de la cámara del EMCCD está abajo a la zona inmediata de la célula-pair. Por otra parte, a expensas de alguna información en z, z un gran paso entre 0,45-0,75 m se puede utilizar para acelerar la adquisición. Imagen bajo estas condiciones pueden durar hasta 6 horas - con continuos segmentos de un minuto 20-60 - con photobleaching mínimo. En total, cada segmento de datos por lo general ocupa 5.20 Gb de espacio, mientras decenas de miles de imágenes son tomadas. Para facilitar el transporte y el análisis de los grandes archivos de datos, cada conjunto de adquisición de las necesidades que se descompone y se exporta como un archivo TIFF Gb segmentos de la imagen utilizando el software v1.8 iQ Andor. A partir de aquí, muchos paquetes de software excelentes que están disponibles para el análisis de imagen, como Metamorph, Volocity y ImageJ (se recomienda su variación Fiji).
Cuando los dos marcadores fluorescentes deben ser seguidos, que al mismo tiempo grabar tanto de ellos sin disminuir la velocidad de adquisición mediante el uso de un "modo de pantalla dividida." Ambos marcadores son excitados por dos líneas diferentes ArKr láser a la vez (a menudo 488 nm y 568). Se inserta directamente delante de la cámara EMCCD es una imagen de separación (OptoSplit II, Cairn, Kent, Reino Unido) que separa las dos imágenes diferentes. Cada imagen es independiente filtrado con filtros de fluorescencia (Semrock) y proyectada de lado a lado de la cámara a la vez la creación de la "pantalla dividida" efecto. Esto requeriría entonces de cultivo manual y alineación de las imágenes más adelante en el procesamiento de imágenes.
7. Consideraciones para el procesamiento de imágenes y análisis de datos
Por lo general el análisis de imágenes con Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) en ordenadores Macintosh (Apple, Inc). Girar imágenes de microscopía confocal láser de disco primero se ajusta en su intensidad para corregir photobleaching, entonces deconvolved con Volocity. Mediciones de la intensidad y el seguimiento de los puntos lagrimales Gag se realiza con el módulo de cuantificación Volocity. Para los conjuntos de imágenes en movimiento con respecto a una sinapsis pre-formado debe ser calculada, un algoritmo de rastreo automático que se utiliza el botón de pistas sináptica a lo largo de toda la secuencia. La inspección manual de las regiones de interés definidas por el software autotracking se deben realizar para confirmar que el software se ha seguido correctamente el objeto deseado. Para los objetos donde el contraste con los objetos que lo rodean es demasiado débil, el seguimiento manual puede llevarse a cabo en un fotograma a fotograma. El paquete de software Volocity permite la exportación de ubicación XYZ, el volumen y la señal integrada en los objetos deseados. La distancia de la sinapsis y la velocidad del objeto seguido se calculan mediante la normalización de los movimientos en el centro del botón sináptico.
8. Resultados representante
Entre 10 y 15 minutos de la mezcla se debe ser capaz de visualizar el VIH iGFP Gag-que expresan las células Jurkat adherirse a células CD4 + en las células T primarias. Imágenes de estos conjugados, uno puede evaluar los movimientos de los puntos lagrimales Gag en las células infectadas, así como en las células diana después de synaspe. Se puede observar el movimiento de los puntos lagrimales Gag-iGFP en las células diana poco después de las sinapsis se forman.
Discussion
Se describe aquí un método sencillo para visualizar la Transmisión del VIH de célula a célula. Una investigación reciente de nuestro laboratorio y otros sugieren que esto puede ser el modo predominante de propagación del VIH entre las células T. El método aquí descrito utiliza una forma recombinante del VIH, llamada Gag del VIH-iGFP, que lleva una etiqueta codificada genéticamente la proteína fluorescente verde en el núcleo estructural de proteínas Gag,. Debido a los altos niveles de GFP se produce en cada partícula de virus, este clon competente para la replicación del VIH permite a los investigadores hacer un seguimiento de partículas individuales de virus en tiempo real. Este virus debe ser especialmente útil en los estudios relativos a la transferencia de montaje y de célula a célula del VIH.
La transferencia del VIH de célula a célula de transferencia es muy eficiente. Durante tres horas de co-cultivo, se ve rutina virus trasladado a un 20-30% de las células T primarias evaluadas por citometría de flujo. Eficiencias similares son cualitativamente visto en imágenes de células vivas. Infectadas por virus las células T comienza la formación de las sinapsis con las células no infectadas principal T casi inmediatamente después de la iniciación del co-cultivo. Interesantes, no todas las principales células T son capaces de interactuar con las células Jurkat infectadas por el VIH a pesar de las interacciones forzadas con pinzas láser (observaciones no publicadas, GM). VIH Gag-iGFP sin duda será útil para determinar subconjuntos de células T que son más susceptibles a la transferencia de células de las células, tanto in vitro como in vivo.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta revisión fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones, AI074420-02, Burroughs Premio al Investigador Wellcome, Hirschl Premios Científicos de Carrera de BKC y por el Centro NSF para Biofotónica Ciencia y Tecnología, Acuerdo de Cooperación PHY012099, y un Sistema de Salud de UCD Premio de Investigación de TH UCD CTSC CNRR ULRR024146.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jurkat T Cells | ATCC | ||
| Leukocyte buffy coats from whole blood | New York Blood Center | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich | ||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | ||
| Nucleofector System and Solution V | Lonza Inc. | ||
| EndoFree Maxi Prep Kits | Qiagen | ||
| HIV Gag-iGFP plasmid | Chen Laboratory | ||
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | ||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | ||
| Celltracker/CellTrace Dyes | Invitrogen | ||
| CO2-Independent Media | Invitrogen | ||
| Imaging Chambers | Ibidi | ||
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | Olympus Corporation | ||
| PlanApo N 1.42NA 60X oil objective | Olympus Corporation | ||
| Innova 70C ArKr ion gas laser | Coherent Inc. | ||
| CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit | Yokogawa | ||
| Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter | Semrock | ||
| 525/50 bandpass filter | Semrock | ||
| iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera | Andor | ||
| ASI 400 Thermostatic Heater | Nevtek |
References
- Blanco, J. High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells. J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).
- Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes. J Virol. 81, 1000-1012 (2007).
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