Summary
La cuantificación de ADN de doble filamento se rompe sobre la base de γH2AX focos se ha convertido en una herramienta de valor incalculable, sobre todo en biología de la radiación, para la evaluación de la radiosensibilidad del tejido y los efectos de los compuestos de la radiación modificar. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido.
Abstract
ADN de doble filamento se rompe (DSBs) son lesiones particularmente letal y genotóxicos, que pueden surgir ya sea por procesos endógenos (fisiológicas o patológicas) o por factores exógenos, particularmente la radiación ionizante y los compuestos radiomimético. La fosforilación de la variante de la histona H2A, H2AX, en la serina-139 de residuos, en el altamente conservadas C-terminal motivo SQEY, formando γH2AX, es una respuesta temprana a las roturas de ADN de doble cadena
Protocol
Tejidos
- Tejido pulmonar, incrustados en los moldes de la temperatura óptima de corte (OCT) compuesto de 4583, se seccionó (5 micras) con una Leica CM 1950 criostato y montado en poli-L-lisina diapositivas.
Las muestras congeladas se obtuvieron del Dr. Simon Royce en Investigación Infantil Murdoch Institute. El tejido pulmonar se obtuvo de ratones Balb tratada / c ratones y de un modelo de ratón de la enfermedad alérgica crónica vías respiratorias, que muestra muchas de las características patológicas del asma humano 6. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Comité de Ética Animal del Instituto de Investigación Infantil Murdoch, que se adhiere al Código Australiano de Prácticas para el cuidado y uso de animales de laboratorio con fines científicos.
- Las secciones se dejan secar al aire a temperatura ambiente durante 1 hora.
La tinción de inmunofluorescencia
- Las secciones fueron fijadas con 2% (w / v) paraformaldehído en tampón fosfato salino (PBS) durante 20 minutos.
- Las secciones se equilibró con dos lavados en PBS durante 15 minutos cada uno.
- Las secciones fueron tratadas con etanol al 70% (refrigerados a -20 ° C) durante 20 minutos seguido de tres lavados en PBS durante 10 minutos cada uno.
En este punto diapositivas se pueden almacenar en recipientes cerrados a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
- Las secciones se lavaron tres veces con PBS durante 10 minutos cada uno y luego bloquearon con 100μL recién preparada en PBS que contenía 8% de BSA en PBS que contenía 0,5% de Tween-20 y 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) durante 1 hora a temperatura ambiente .
Todas las incubaciones se realizaron en un canal de tinción humidificado. - Las secciones fueron lavadas con PBS-TT durante 5 minutos y un perímetro hidrofóbica se ha caracterizado en todo el tejido con un lápiz de Papanicolaou.
- El exceso de tampón fue advertido y 100μl de conejo primario policlonal anti-γH2AX anticuerpos (diluido 1:500, en el 1% de BSA en PBS, Millipore), se añadió a cada sección de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente.
La incubación con el anticuerpo primario puede llevar a cabo la noche a 4 ° C.
Para más evidencia, que representan focos γH2AX DSBs, un anticuerpo primario reconocer una proteína de reparación del OSD también se puede utilizar. Por ejemplo, co-localización de γH2AX y fosfo-ATM es una combinación de uso común. - Las secciones se lavaron dos veces en PBS-TT de 5 minutos cada uno y se incubaron con 100μl del anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de conejo diluido 1:500, en el 1% de BSA, Invitrogen) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad . (Anticuerpo diluido se mantuvo en la oscuridad durante todo el procedimiento).
- Las secciones se lavaron tres veces con PBS-TT de 5 minutos cada uno y se incubaron con 0.5mg/mL RNAsa A durante 30 minutos a 37 ° C.
- Nucleares contratinción y el montaje se realizó con medio Vectashield que contiene yoduro de propidio.
- Las diapositivas fueron sellados con esmalte de uñas y se almacena la noche a 4 ° C en la oscuridad, antes del análisis.
Microscopía / Análisis
- Un microscopio confocal Zeiss LSM510 Meta fue utilizado para adquirir imágenes con la GFP estándar (por γH2AX - Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgG) y PI (543 nm).
Las imágenes fueron adquiridas en un modelo de la serie Z con un tamaño de paso de 0,5 micras. Durante el análisis, los planos individuales deconvoluted y apilados para producir una imagen proyectada máxima para minimizar la superposición de los focos.
El método de creación de una imagen proyectada máxima antes de un conteo de partículas sólo debe utilizarse en circunstancias en que se utiliza una sección delgada (por ejemplo, 5μm) y en la tinción de fondo es insignificante. Donde las secciones más gruesas con un fondo importante debe ser analizado, un análisis más complejos, tales como contador de objetos 3D como se describe por Bolte y Cordelières (2006) debe ser utilizado 7.
- Metamorph (Molecular Devices, EE.UU.) se utilizó para crear fusión (rojo y verde) las imágenes para cuantificar el número de focos.
Aunque Metamorph se puede utilizar para cuantificar el número focos, por lo general cuando se utilizan las secciones de tejido focos se cuentan manualmente (a ojo) para mayor precisión.
Los tipos específicos de células de interés pueden ser seleccionados para la cuantificación, por ejemplo, las células pulmonares epiteliales. Esto se puede hacer sobre la base de la histología y con referencia a la hematoxilina y eosina secciones teñidas de serie.
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Discussion
Con el propósito de esta demostración se utilizó tejido de ratón de pulmón de ratones Balb tratada / c ratones y de un modelo de ratón de la enfermedad alérgica crónica vías respiratorias. Hemos cuantificado las diferencias en el número de focos por celda, con un promedio ligeramente superior observada en el pulmón dañado en comparación con las secciones sin tratar. En concreto, la cuantificación se indica 6,5 por focos / celular y el 9,4 por focos / célula (el conteo manual de 20 células por sección), en el tejido sin tratar y crónica del tejido alérgica de las vías aéreas, respectivamente. Sin embargo, el uso de un agente inductor del OSD, por ejemplo naftaleno, que se sabe que inducen DSBs en el modelo de pulmón de ratón, daría un mayor número de focos. De hecho, este protocolo es el más adecuado para la investigación de los efectos de las radiaciones ionizantes en los tejidos, los resultados más sorprendentes en términos de números γH2AX focos y la resolución se obtienen cuando se utiliza la radiación ionizante. Es bien sabido que tras la exposición a los rayos X, γH2AX forma rápida los focos y los números de focos de alcanzar un máximo entre los 30-60 minutos 2. Por lo tanto, los puntos 1 hora de tiempo (después de la irradiación) son ideales para la evaluación inicial de la formación de OSD y tiempos más largos (normalmente hasta 48 horas) puede ser usado para monitorear la reparación del ADN.
En general, la cuantificación de γH2AX en los tejidos es útil para monitorear la formación de OSD y la reparación. Aparte de su utilidad en el contexto de las radiaciones ionizantes, el método puede ser aplicado a la evaluación de la eficacia de los compuestos que inducen OSD en varios tejidos, por ejemplo, las antraciclinas comúnmente utilizados contra el cáncer, como la doxorrubicina se sabe que causan DSBs y, potencialmente, monitor diversas enfermedades que se caracterizan por las especies reactivas de oxígeno mediada DSBs. Es importante destacar que este protocolo es adecuado para tejidos de ratón diferente.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El apoyo del Instituto Australiano de Ciencia Nuclear e Ingeniería se reconoce. TCK es el ganador de premios AINSE. Laboratorio de Medicina epigenómico el apoyo de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (566.559). LM con el apoyo de Melbourne de Investigación (Universidad de Melbourne) y de Imágenes Biomédicas becas complementarias CRC. El apoyo de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody y Carmichael Iska) fue muy valiosa para este trabajo. MMT se agradece la asistencia y asesoramiento de la Dra. Olga Sedelnikova de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
