Summary
Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.
Abstract
DNA double-strand breaks (LAP) são lesões particularmente letal e genotóxicas, que podem surgir tanto por processos endógenos (fisiológica ou patológica) ou por fatores exógenos, a radiação ionizante e compostos principalmente radiomimético. Fosforilação da variante histona H2A, H2AX, na serina-139 resíduos, na altamente conservada motivo SQEY C-terminal, formando γH2AX, é uma resposta inicial ao DNA de fita dupla-breaks
Protocol
Tecidos
- Tecido pulmonar, embutidos em moldes de temperatura de corte ideal (OCT) composto de 4583, foi seccionado (5 mm) usando uma Leica CM 1950 criostato e montados em poli-L-lisina slides.
As amostras congeladas foram obtidos a partir Dr Simon Royce Research the Children Murdoch Institute. Tecido pulmonar foi obtido a partir Balb não tratada / c camundongos e de um modelo do rato de doenças crônicas das vias aéreas alérgicas que mostra muitas das características patológicas da asma humana 6. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Instituto da Criança Murdoch Research que adere ao Código de Práticas para Australian o cuidado e uso de animais de laboratório para fins científicos.
- Secções foram secas ao ar em temperatura ambiente por 1 hora.
Imunofluorescência
- Secções foram fixadas com 2% (w / v) paraformaldeído em tampão fosfato salino (PBS) por 20 minutos.
- Seções foram equilibradas com duas lavagens em PBS por 15 minutos cada.
- Cortes foram tratados com etanol 70% (refrigerados a -20 ° C) por 20 minutos, seguida de três lavagens em PBS por 10 minutos cada.
Neste ponto slides podem ser armazenadas em recipientes fechados, a 4 ° C por até duas semanas.
- Cortes foram lavados três vezes com PBS por 10 minutos cada e, em seguida, bloqueadas com 100μL preparada em PBS contendo BSA 8% em PBS contendo 0,5% Tween-20 e 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) por 1 hora em temperatura ambiente .
Todas as incubações foram realizadas em um cocho de coloração umidificado. - Cortes foram lavados com PBS-TT por 5 minutos e um perímetro hidrofóbico foi marcado em todo o tecido com uma caneta Pap.
- Tampão em excesso foi derrubado fora e 100μl do ensino primário de coelho anti-anticorpo policlonal γH2AX (diluído 1:500 em BSA 1% em PBS, Millipore), foi adicionado a cada seção para incubação de duas horas à temperatura ambiente.
Incubação com anticorpo primário pode ser realizada durante a noite a 4 ° C.
Para mais provas, que representam focos γH2AX LAP, um anticorpo primário que reconhece uma proteína de reparo DSB também pode ser usado. Por exemplo, co-localização de γH2AX e fosfo-ATM é uma combinação comumente usados. - Cortes foram lavados duas vezes em PBS-TT por 5 minutos cada e incubadas com 100μl de anticorpo secundário (Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho diluído 1:500 em BSA 1%; Invitrogen) por 1 hora à temperatura ambiente no escuro . (Anticorpo diluído foi mantido no escuro durante todo o procedimento).
- Cortes foram lavados três vezes com PBS-TT por 5 minutos cada e incubadas com 0,5 mg de RNAse A por 30 minutos a 37 ° C.
- Nuclear contracoloração e montagem foi realizada com Vectashield meio contendo iodeto de propídio.
- As lâminas foram seladas com unha polonês e armazenados durante a noite a 4 ° C no escuro antes da análise.
Microscopia / Análise
- A Zeiss Microscópio Confocal Meta LSM510 foi usado para aquisição de imagens utilizando a GFP padrão (para γH2AX - Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho) e PI (543 nm) lasers.
Imagens foram adquiridas em um padrão Z-série com um tamanho de passo de 0,5 micron. Durante a análise, planos individuais foram deconvoluídos e empilhados para produzir uma imagem máxima projetada para minimizar a sobreposição de focos.
O método de criação de uma imagem projetada no máximo antes de uma contagem de partículas só deve ser utilizado em circunstâncias em que uma seção fina (por exemplo, 5m) é usado e onde a coloração de fundo é insignificante. Onde as seções mais grossas com um fundo significativos devem ser analisados, uma análise mais complexa, como Contador de objetos 3D, como descrito por Bolte e Cordelières (2006) deve ser usado 7.
- Metamorph (dispositivos Molecular, EUA) foi usado para criar mescladas (vermelho e verde) imagens para quantificar o número de focos.
Embora Metamorph podem ser usados para quantificar números de focos, geralmente quando utilizando secções de tecido focos são contados manualmente (por olho) para maior precisão.
Tipos de células específicas de interesse podem ser selecionados para quantificação, por exemplo, células epiteliais do pulmão. Isso pode ser feito com base na histologia e com referência a cortes corados hematoxilina e eosina serial.
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Discussion
Para os fins desta demonstração foram utilizados a partir de tecido pulmonar do rato não tratada Balb / c infectados e de um modelo do rato de doenças crônicas das vias aéreas alérgicas. Nós quantificada diferenças no número de focos por célula com médias um pouco maior observada no pulmão danificado em comparação com seções não tratada. Especificamente, a quantificação indicou 6,5 por focos / célula e 9,4 focos por célula / (contagem manual de 20 células por seção), no tecido não tratados e de tecido doença alérgica crônica das vias aéreas, respectivamente. No entanto, o uso de um agente indutor de DSB, por naftaleno exemplo, que é conhecido por induzir a LAP no modelo de pulmão mouse, renderia um maior número de focos. Na verdade, este protocolo é mais adequado para a investigação dos efeitos da radiação ionizante nos tecidos; resultados mais surpreendentes, em termos de números de focos γH2AX e resolução são obtidas quando a radiação ionizante é utilizada. É bem conhecido que após a exposição a raios-X, γH2AX focos forma rápida e números de focos atingir um máximo entre 30-60 minutos 2. Portanto, 1 pontos horas de tempo (pós-irradiação) são ideais para avaliar a formação inicial e DSB vezes mais longos (normalmente até 48 horas) pode ser usado para monitorar o reparo do DNA.
No geral, a quantificação da γH2AX em tecidos é útil para monitorar DSB formação e reparação. Além de sua utilidade no contexto de radiação ionizante, o método pode ser aplicado a avaliação da eficácia do DSB-indução de compostos em vários tecidos, por exemplo, o comumente usado anticâncer antraciclinas, tais como a doxorrubicina são conhecidos por causar LAP e, potencialmente, para monitorar diversas patologias que se caracterizam por espécies reativas de oxigênio mediadas por LAP. Importante, este protocolo é adequado para os tecidos do mouse diferente.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O apoio do Instituto Australiano de Ciência Nuclear e Engenharia é reconhecido. TCK foi o ganhador de prêmios AINSE. Lab Medicine epigenômico é suportado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM é apoiada por Melbourne Research (University of Melbourne) e Biomedical Imaging bolsas complementares CRC. O apoio de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody e ISKA Carmichael) foi inestimável para este trabalho. MMT é grato pela assistência especializada e conselhos do Dr. Olga Sedelnikova do National Institutes of Health.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
