التحليل الجرثومي التعبير الجيني عن طريق ميكروأرس]

Summary

Protocol

عكس رد الفعل الناسخ

بدوره كتلة التدفئة إلى 70-80 درجة مئوية و 42 درجة مئوية. ويمكن أيضا أن تستخدم حمامات المياه في هذه الخطوة. إذا باستخدام كتل التدفئة ، ووضع بعض الماء بحيث الحرارة موحدة.

1. رد فعل فتيلة
   1. يستغرق 3 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي
   2. ضبط مستوى الصوت إلى 13 ميكرولتر مع المياه مجانا ريبونوكلياز
   3. إضافة 2.5 ميكرولتر من الاشعال مسدوس العشوائي (2mg/mL)
2. مزيج جيد واحتضان في 70-80 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. ثم ، ضع على الجليد لمدة 5 دقائق.
3. تحضير الكوكتيل RT (14.5 ميكرولتر / rxn) :
   
   

   مكون	حجم
   5X العازلة ستراند الأولى	6 ميكرولتر
   0.1 M DTT	3 ميكروليتر
   25X aminoallyl - dNTP مزيج	1.2 ميكرولتر
   RT مرتفع الثاني (200U/μl)	2.3 ميكرولتر
   ماء	2.0 ميكرولتر

   
   * للحصول على ردود الفعل ن ، وإعداد ميكس الرئيسية للaliquots +0.5 ن من الكوكتيل لضمان أنك لن ينفد.
   
   
4. إضافة إلى ردود فعل 14.5 ميكرولتر تبريده.
5. مزيج (لا الدوامة) ، ويحضن في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعات
6. ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.

يتحلل RNA

1. لكل عينة ، إضافة 3 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم N 1 و 0.6 ميكرولتر من EDTA M 0.5. (النهائي conc.s = هيدروكسيد الصوديوم 100mM ، 10MM EDTA)
2. خلط واحتضان عند 65 لمدة 10 دقائق درجة مئوية.
3. تحييد بإضافة 33.6 HEPES 1M ميكرولتر ، ودرجة الحموضة = 7.0 (اضرب النهائي.= HEPES 500mM)
4. ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية ، إذا لزم الأمر.

تنقية رد فعل : إزالة الفردية AA - dUTP والأمينات مجانا

ملاحظة : يتم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول تنقية QIAquick Qiagen PCRpurification عدة. يتم استبدال غسل الفوسفات ومخازن مخازن للشطف Qiagen الموردة لأن مخازن تحتوي على الأمينات Qiagen الحرة التي تتنافس مع اقتران رد فعل قبرصي صباغة. ويمكن أيضا الأعمدة من مجموعة مصغرة الإعدادية استخدامها.

1. [كدنا] مزيج التفاعل مع 300 ميكرولتر (أو حجم رد الفعل 5X = 336 ميكرولتر) العازلة PB (Qiagen الموردة) ونقل إلى العمود QIAquick.
2. وضع عمود في أنبوب جمع 2 مل (Qiagen الموردة) والطرد المركزي في دورة في الدقيقة ل13000 ~ 1 دقيقة. جمع أنبوب فارغ.
3. للاغتسال وغسل الفوسفات إضافة 750 ميكرولتر العازلة (لا Qiagen) إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي في دورة في الدقيقة ل13000 ~ 1 دقيقة.
4. تفريغ أنبوب جمع وتكرار غسل 750 ميكرولتر وخطوة الطرد المركزي.
5. تفريغ أنبوب جمع وأجهزة الطرد المركزي لعمود إضافي 1 دقيقة بأقصى سرعة ممكنة.
6. نقل عمود إلى أنبوب جديد 1.5 مل microfuge بعناية وإضافة 30 شطف الفوسفات ميكرولتر العازلة. (انظر القسم حل الإعداد)
7. احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
8. أزل بواسطة الطرد المركزي في دورة في الدقيقة ل13000 ~ 1 دقيقة.
9. أزل مرة ثانية (مع آخر ميكرولتر 30 من شطف العازلة الفوسفات) في أنبوب نفس الخطوات تكرار 6-8. ينبغي أن يكون حجم شطف النهائي ~ 60 ميكرولتر.
10. ويمكن قياس كمية [كدنا] في هذه المرحلة :
    [كدنا] = نانوغرام (عامل تمييع) (OD260) (37) (إجمالي حجم eluted من عمود)
11. العينة الجافة في سرعة بطالة في 45 درجة مئوية.
12. ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.

اقتران AA - [كدنا] [سي] إلى صبغ استر

1. Resuspend aminoallyl المسمى [كدنا] مع 10 ميكرولتر 50 ملي درجة الحموضة ، بيكربونات الصوديوم = 9.0 - إذا لزم الأمر. (وينبغي بذل هذا المخزن جديدة كل أسبوعين)
2. العمل في مكان مظلم ، إضافة إلى التحقيق أنبوب الصبغة قبرصي المناسبة. الماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لresuspend الصبغة.
3. احتضان رد فعل لمدة 1 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. (الحضانة يمكن أن تصل إلى ساعتين)

رد الفعل الثاني التنقية : إزالة الصبغة uncoupled

1. إضافة إلى رد فعل 35 ميكرولتر 100 درجة الحموضة 5.2 ملي NaOAc. مزيج دقيق.
2. إضافة 250 ميكرولتر (أو حجم رد الفعل 5X = 225 ميكرولتر) العازلة PB (Qiagen الموردة) لكل عينة وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا.
3. مكان عمود الدوران QIAquick في أنبوب جمع 2 مل (Qiagen مرفق) ، تطبيق نموذج إلى عمود ، والطرد المركزي في ~ 13000 : 1 دقيقة. جمع أنبوب فارغ.
4. لغسل ، إضافة 0.75 مل العازلة بي (Qiagen مرفق) إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي في ~ 13000 : 1 دقيقة.
5. كرر الخطوة 4.
6. أنبوب فارغ جمع وأجهزة الطرد المركزي لعمود 1 دقيقة إضافية في أقصى سرعة.
7. عمود في مكان نظيف 1.5 مل أنبوب microfuge بعناية وإضافة 30 ميكرولتر EB العازلة (Qiagen مرفق) الى مركز للغشاء العمود.
8. احتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
9. أزل بواسطة الطرد المركزي في دورة في الدقيقة ل13000 ~ 1 دقيقة.
10. أزل للمرة الثانية في الأنبوب نفسه بتكرارالخطوات 7-9. ينبغي أن يكون الحجم النهائي eluted ~ 60 ميكرولتر.

تحليل ردود الفعل وصفها

ويمكن قياس كمية [كدنا] والتسمية في هذه المرحلة :

• قياس OD 260 ، 550 و 650 (فارغ هو الماء.) استخدام برنامج nanodrop ميكروأري.
• حساب بمول التأسيس الأصباغ والحمض النووي ونسبة بمول مجلس التوحيد الوطنى / صبغ مع المعادلات الواردة أدناه :
  
  النيوكليوتيدات بمول = [OD260 * الحجم (ميكرولتر) * 37 نانوغرام / ميكرولتر * 1000 جزء من الغرام / نغ] / 324.5 بيكوغرام / بمول

ملاحظة : 1 OD260 = 37 نانوغرام / ميكرولتر ل[كدنا] ؛ 324.5 بيكوغرام / بمول وزن جزيئي متوسط ​​dNTP)
بمول Cy3 = حجم OD550 * (ميكرولتر) / 0.15
بمول Cy5 = OD650 * الحجم (ميكرولتر) / 0.25
النيوكليوتيدات / نسبة الصبغة = بمول [كدنا] / بمول قبرصي صبغ

إذا كنت تستخدم nanodrop ، فإنه يعطي بالفعل بمول / ميكرولتر لكل صباغة. تحتاج فقط لمضاعفة هذا العدد من حيث الحجم الكلي للحصول على إدماج صبغ بمول.

ملاحظة :> 150-200 بمول التأسيس صبغ لكل عينة ونسبة أقل من 20 النيوكليوتيدات / جزيئات الصبغة هو الأمثل لالتهجين.

• ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية في الظلام.
  • تجمع تحقيقات المهجنة لتكون معا والجافة في أسفل speedvac حوالي 42 درجة مئوية.
  • ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للhyb.

قبل hyb الشرائح

1. مكان وجه الانزلاق على الماء RT 100 مل في حامل الشريحة الحمراء نظيفة لمدة 3-5 دقائق
2. المفاجئة الجافة الشريحة من خلال وضع مواجهة على 100 درجة مئوية لتسخين كتلة بضع ثوان -- مشاهدة لالتكثيف إلى الزوال
3. الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط الشريحة ب 250 mJoules (2500 أدخل إلى crosslinker الأشعة فوق البنفسجية)
4. هيدرات الشرائح التي غمس في مرحلة ما قبل حرارة المياه 42 درجة مئوية. تدور 5 دقائق عند 700 دورة في الدقيقة في RT.
5. احتضان الشرائح في جرة تحتوي على Coplin 50ml قبل تدفئته قبل hyb (5XSSC ، BSA 1 ٪ ، 0.1 ٪ SDS) ما لا يقل عن 45 دقيقة @ 42 درجة مئوية ويمكن ، وحضانة يذهب لفترة أطول إذا لزم الأمر.
   
   50 مل قبل hyb العازلة : 12.5 مل 20X SSC ، 10 مل BSA 5 ٪ ، و 0.5 مل SDS 10 ٪ ، و 27 مل من الماء
   
   
6. تراجع الشرائح في مرحلة ما قبل حرارة المياه (42 درجة مئوية) ، وتستنهض الهمم بضع دقائق لإزالة ما قبل hyb العازلة.
7. شطف في الأيزوبروبانول وتدور 5 دقائق عند 700 دورة في الدقيقة ، درجة حرارة الغرفة ، وجفاف.

إعداد العينات للتهجين

1. Resuspend التحقيق في الماء (يتم إعطاء كميات أدناه)
   
   

   لمجموع المجلد. = 30μl	لمجموع المجلد. = 35μl	لمجموع 40μl المجلد.=
   19.8 ميكرولتر المياه	23.55 المياه ميكرولتر	27.2 ميكرولتر المياه
   1.5 ميكرولتر	1.5 ميكرولتر	1.5 ميكرولتر	10 الحيوانات المنوية السلمون ملغ / مل الحمض النووي (Invitrogen)
   1.2 ميكرولتر	1.2 ميكرولتر	1.2 ميكرولتر	12.5 ملغ / مل الحمض الريبي النووي النقال
   4.5 ميكرولتر	5.25 ميكرولتر	6 ميكرولتر	20XSSC (3X النهائي)
   3 ميكروليتر	ميكرولتر 3.5	4 ميكرولتر	1 ٪ SDS

   
   ملاحظة : ترتيب إضافة الكواشف هامة. لا تحضير مزيج الرئيسي.
   
   
2. يغلي لمدة 5 دقائق ، وتدور ثم 5 دقائق في 14000 دورة في الدقيقة. تبرد لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

تهجين

1. إضافة 10-12 ميكرولتر من SSC 3X إلى آبار للغرفة التهجين وعلى كل حافة في الوسط.
2. إضافة زلة رافعة النظيفة إلى منطقة مناسبة لشريحة وتحميل بلطف في محلول التهجين (30 -40 ميكرولتر). يجب أن يكون هناك إما عينة اضافية على حافة الانزلاق الغطاء.
3. ضع الشريحة في الغرفة. تضييق الخناق ووضع في حمام الماء 65 درجة مئوية خلال الليل. لا مكان للغرفة مباشرة على الجزء السفلي من حمام الماء. وضع على رأس كتلة من الغرفة العلوية لاجراء كل شيء في مكانه. إبقاء الغطاء على حمام مائي لحماية العينات ضوء الحساسة.

Hyb الغسلات

1. إعداد المخازن التالية :
   • 1X SSC ، SDS 0.05 ٪
   • 0.06 X SSC
2. بعد التهجين غرفة الحضانة فضها. إزالة الشريحة من الغرفة ، مع الحرص على عدم تعكير صفو ساترة.
3. لإزالة coverslips ، والشرائح يغرق في صحن يحتوي على الحارة 1X SSC ، 0.05 ٪ العازلة غسل SDS ساترة تواجه قاع الطبق. سوف تسقط ساترة عن طريق تحريك الجانب الانزلاق الى جنب.
4. بعد إزالة ساترة ، ضع الشريحة في رف حمام جديدة مع الحزب الديمقراطي الصربي 1XSSCm الدافئة 0.05 ٪. تستنهض الهمم لبضع دقائق
5. نقل الشرائح بالإضافة إلى رف الحمام SSC X 0.06.
6. نقل الشرائح إلى آخر باعشر من 0.06 X SSC تحتوي على الرف الطازجة والنشاف الشريحة على منشفة ورقية لإزالة قدر SDS العازلة التي تحتوي على قدر الإمكان قبل وضعه في حوض الاستحمام جديدة.
7. تستنهض الهمم الشرائح لبضع دقائق.
8. تدور على الفور في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الدقيقة 700 @ ، ثم الشرائح على استعداد للفحص. مخزن في الظلام حتى الممسوحة ضوئيا.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer	Buffer			For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer	Buffer			Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.