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Biology

使用微阵列的细菌基因表达分析

Published: May 28, 2007 doi: 10.3791/206

Summary

Protocol

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逆转录反应

关闭加热块到70-80 ° C和42 ° C。水浴也可以用在这一步。如果使用加热块,放一些水,使热量均匀。

  1. 底漆反应
    1. 取3微克的RNA
    2. 调整音量与核糖核酸酶自由水至13μL
    3. 加入2.5μL的六聚体随机引物(2mg/mL)
  2. 搅拌均匀,在70-80℃孵育8分钟。然后,放置在冰浴5分钟。
  3. 准备RT鸡尾酒(14.5μL/ RXN):

    组件
    5X第一链缓冲 6μL
    0.1中号数码地面电视
    3μL
    25X aminoallyl dNTP混合液 1.2μL
    标II RT(200U/μl) 2.3μL

    2.0μL

    * n个反应,准备为n等分0.5鸡尾酒法师组合,以保证你不会用完。

  4. 加入14.5μL冷却反应。
  5. 混合(不要旋涡),并在42 ° C孵育3-4小时
  6. 如有必要,样品可以储存在-20 ° C。

水解的RNA

  1. 每个样品中,添加3μL的1 N NaOH和0.6μL0.5 M EDTA。 (最后conc.s = 100MM 10MM EDTA的氢氧化钠,)
  2. 混合并孵育65 ° 10分钟。
  3. 加入33.6μL1M HEPES中性,pH值= 7.0(终浓度.= 500MM HEPES)
  4. 样品可以储存在-20 ° C,如有必要。

反应净化:清除非法人AA -的dUTP和自由胺

:此净化协议是从Qiagen公司的QIAquick PCRpurification套件协议的修改。 Qiagen公司提供的缓冲区,因为Qiagen公司的缓冲区包含自由竞争与CY染料偶联反应的胺取代磷酸盐的洗涤和洗脱缓冲液。也可用于从小型预习套件列。

  1. 300μL(或5X反应体积= 336μL)缓冲液PB(QIAGEN提供)混合cDNA反应,并转移到QIAquick列。
  2. 将在2 ml收集管中柱(QIAGEN提供)离心1分钟〜13000 RPM。清空收集管。
  3. 要洗净,加750μL磷酸盐缓冲液洗(不Qiagen公司)列和离心1分钟〜13000 RPM。
  4. 清空收集管,重复750μL洗涤和离心步骤。
  5. 清空收集管,并以最大的速度增加1分钟离心列。
  6. 列转移到一个新的1.5 ml离心管,小心地添加30μL磷酸盐洗脱缓冲液。 (见溶液的制备部分)
  7. 孵育1分钟室温。
  8. 1分钟〜13000 RPM离心洗脱。
  9. 第二次(与其他磷酸盐洗脱缓冲液30μL)重复步骤6-8到同一管流出。最终洗脱体积应〜60μL。
  10. 在这个阶段,可以量化的cDNA量:
    吴的cDNA =(稀释倍数)(OD260)(37)(总量列洗脱)
  11. 干样的速度在45 VAC ° C。
  12. 如有必要,样品可以储存在-20 ° C。

耦合AA基因CY染料酯

  1. 悬浮aminoallyl标记的cDNA 10μL50毫米钠碳酸氢盐,pH值= 9.0,如果必要的。 (此缓冲区应该是新鲜,每两个星期)
  2. 在黑暗的地方工作,加上适当的Cy染料管探头。吸取最多几次悬浮染料。
  3. 反应在室温避光孵育1小时。 (孵化可以去两个小时)

反应净化:去除耦合染料

  1. 添加35μL100毫米NaOAc pH值5.2的反应。调匀。
  2. 加入250μL(或5X反应体积= 225μL)缓冲区PB(QIAGEN提供)上下吹打每个样品和混合。
  3. 将在2毫升收集管QIAquick离心柱(QIAGEN提供),适用于样品列,离心1分钟〜13000。清空收集管。
  4. 要洗净,加0.75 mL缓冲液PE(QIAGEN提供)1分钟〜13000列和离心机。
  5. 重复步骤4。
  6. 空集合管和离心机以最大的速度增加1分钟的列。
  7. 地点列在一个干净的1.5 ml离心管,小心地加入30μl的缓冲液EB(QIAGEN提供)列膜的中心。
  8. 孵育1分钟室温。
  9. 1分钟〜13000 RPM离心洗脱。
  10. 重复第二次到同一管流出步骤7-9。最后的洗脱体积应〜60μL。

标记反应分析

在这个阶段可以量化的cDNA量和标签:

  • 测量外径260,550和650(空白是水。)使用nanodrop的芯片方案。
  • 计算pmol染料掺入pmol的DNA与国统会/染料的比例给予下面公式:

    pmol核苷酸= [OD260 *量(μl)* 37毫微克/μL* 1000皮克/ NG] / 324.5 PG / pmol

:1 OD260 = 37纳克/μLcDNA的; 324.5 pg / pmol的一个dNTP的平均分子量)
pmol Cy3标记= OD550 *量(μl)/ 0.15
pmol Cy5的量(μl)/ 0.25 = OD650
核苷酸/染料比率= pmol的cDNA / pmol赛扬染料

如果您正在使用nanodrop的,它已经给每个染料pmol /μL。你只需要这个数字乘以数量得到总pmo​​l染料掺入。

:> 150-200 pmol染料掺入每个样品的比例小于20个核苷酸/染料分子杂交的最佳选择。

  • 在黑暗的样品可以储存在-20 ° C。
    • 结合探针杂交在一起,干倒在Speed​​Vac在42 ° C。
    • 样品可以储存在-20 ° C,直到准备来HYB。

前HYB幻灯片

  1. 放置滑面,跌幅超过RT 100毫升水3-5分钟,在一个干净的红色幻灯片持有人
  2. 对齐干,放置在100℃加热块面对几秒钟的幻灯片 - 手表凝结消失
  3. 紫外光交联在250 mJoules幻灯片(紫外线交联剂输入2500)
  4. 预热42℃的热水中浸渍水合物的幻灯片。旋转700 RPM在室温5分钟。
  5. 孵育于50ml Coplin JAR幻灯片包含至少45分钟的预热预HYB(5XSSC,1%BSA,0.1%SDS)@ 42 ° C,并且潜伏期可以去如果必要的时间。

    50毫升HYB前缓冲区:12.5毫升20X SSC,10毫升5%BSA,0.5毫升10%SDS,27 mL水

  6. DIP幻灯片和预热水(42℃)搅拌几分钟删除前HYB缓冲区。
  7. 异丙醇冲洗和旋转700 RPM,室温,干燥5分钟。

准备样品杂交

  1. 悬浮在水中的探头(卷下面给出)

    对于总卷。 =30μl
    对于总卷。 =35μl
    总卷.=40μl
    19.8μL水
    23.55μL水
    27.2μL水

    1.5μL 1.5μL 1.5μL 10毫克/毫升的鲑鱼精子DNA(Invitrogen公司)
    1.2μL 1.2μL 1.2μL 12.5毫克/毫升的tRNA
    4.5μL 5.25μL 6μL 20XSSC(3X最后)
    3μL 3.5μL 4μL 1%SDS

    :此外试剂的顺序是很重要的。不要准备预混。

  2. 煮沸5分钟,然后旋转14000转5分钟。室温2分钟冷却。

杂交

  1. 加入10-12μl的3倍SSC的每个边缘和中间的杂交室井。
  2. 添加清洁升降机滑幻灯片的适当区域,并在杂交液轻轻加载(30 -40μL)。应该有额外的样品任盖玻片边缘。
  3. 放置在会议厅内的幻灯片。拧紧螺钉和​​地方在65℃水浴过夜。不要直接放在水浴底部的腔。至上腔顶部放置一个块保存一切就绪。继续水浴盖子保护光敏感的样品。

HYB洗

  1. 准备以下的缓冲区:
    • 1X SSC,0.05%SDS
    • 0.06 X SSC
  2. 孵化后启封杂交室。从试验箱中取出的幻灯片,小心不要打扰盖玻片。
  3. 要删除盖玻片,淹菜中含有温暖1X SSC,0.05%SDS的缓冲液洗盖玻片面临的菜底部的幻灯片。盖玻片会脱落移动幻灯片一边到另一边。
  4. 盖玻片后取出,放置在一个温暖1XSSCm 0.05%SDS的机架新鲜浴的幻灯片。鼓动几分钟
  5. 将幻灯片加上机架0.06 X SSC洗澡。
  6. 幻灯片传输到另一个BA日的0.06 X SSC包含一个新的机架,在纸巾上的印迹幻灯片之前删除尽可能多的SDS含缓冲区尽可能放置在新鲜浴。
  7. 搅拌几分钟的幻灯片。
  8. 立即在室温下自旋为5分钟700转,然后幻灯片准备扫描。商店在黑暗中,直到扫描。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
AA-dUTP Sigma-Aldrich A0410 5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP Amersham 27-2035-01 100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers Amersham 27-2166-01 3mg/mL
SuperScript III RT Invitrogen 80800444 200U/μL
CyDye™ Amersham RPN5661 Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick Qiagen 28104 PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4 Buffer To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer Buffer For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer Buffer Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer (Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.

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References

  1. Hasseman, J. TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for. Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. Forthcoming.
  2. Gilbert,, et al. TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels. Forthcoming.
  3. Hedge,, et al. A concise guide to cDNA Microarray analysis-II. Forthcoming.
使用微阵列的细菌基因表达分析
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Beyhan, S., Yildiz, F. Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays. J. Vis. Exp. (4), e206, doi:10.3791/206 (2007).More

Beyhan, S., Yildiz, F. Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays. J. Vis. Exp. (4), e206, doi:10.3791/206 (2007).

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