Summary
Protocol
逆转录反应
关闭加热块到70-80 ° C和42 ° C。水浴也可以用在这一步。如果使用加热块，放一些水，使热量均匀。
- 底漆反应
- 取3微克的RNA
- 调整音量与核糖核酸酶自由水至13μL
- 加入2.5μL的六聚体随机引物（2mg/mL）
- 搅拌均匀，在70-80℃孵育8分钟。然后，放置在冰浴5分钟。
- 准备RT鸡尾酒（14.5μL/ RXN）：
组件 卷 5X第一链缓冲 6μL 0.1中号数码地面电视 3μL 25X aminoallyl dNTP混合液 1.2μL 标II RT（200U/μl） 2.3μL 水 2.0μL
* n个反应，准备为n等分0.5鸡尾酒法师组合，以保证你不会用完。 - 加入14.5μL冷却反应。
- 混合（不要旋涡），并在42 ° C孵育3-4小时
- 如有必要，样品可以储存在-20 ° C。
水解的RNA
- 每个样品中，添加3μL的1 N NaOH和0.6μL0.5 M EDTA。 （最后conc.s = 100MM 10MM EDTA的氢氧化钠，）
- 混合并孵育65 ° 10分钟。
- 加入33.6μL1M HEPES中性，pH值= 7.0（终浓度.= 500MM HEPES）
- 样品可以储存在-20 ° C，如有必要。
反应净化：清除非法人AA -的dUTP和自由胺
注 ：此净化协议是从Qiagen公司的QIAquick PCRpurification套件协议的修改。 Qiagen公司提供的缓冲区，因为Qiagen公司的缓冲区包含自由竞争与CY染料偶联反应的胺取代磷酸盐的洗涤和洗脱缓冲液。也可用于从小型预习套件列。
- 300μL（或5X反应体积= 336μL）缓冲液PB（QIAGEN提供）混合cDNA反应，并转移到QIAquick列。
- 将在2 ml收集管中柱（QIAGEN提供）离心1分钟〜13000 RPM。清空收集管。
- 要洗净，加750μL磷酸盐缓冲液洗（不Qiagen公司）列和离心1分钟〜13000 RPM。
- 清空收集管，重复750μL洗涤和离心步骤。
- 清空收集管，并以最大的速度增加1分钟离心列。
- 列转移到一个新的1.5 ml离心管，小心地添加30μL磷酸盐洗脱缓冲液。 （见溶液的制备部分）
- 孵育1分钟室温。
- 1分钟〜13000 RPM离心洗脱。
- 第二次（与其他磷酸盐洗脱缓冲液30μL）重复步骤6-8到同一管流出。最终洗脱体积应〜60μL。
- 在这个阶段，可以量化的cDNA量：
吴的cDNA =（稀释倍数）（OD260）（37）（总量列洗脱） - 干样的速度在45 VAC ° C。
- 如有必要，样品可以储存在-20 ° C。
耦合AA基因CY染料酯
- 悬浮aminoallyl标记的cDNA 10μL50毫米钠碳酸氢盐，pH值= 9.0，如果必要的。 （此缓冲区应该是新鲜，每两个星期）
- 在黑暗的地方工作，加上适当的Cy染料管探头。吸取最多几次悬浮染料。
- 反应在室温避光孵育1小时。 （孵化可以去两个小时）
反应净化：去除耦合染料
- 添加35μL100毫米NaOAc pH值5.2的反应。调匀。
- 加入250μL（或5X反应体积= 225μL）缓冲区PB（QIAGEN提供）上下吹打每个样品和混合。
- 将在2毫升收集管QIAquick离心柱（QIAGEN提供），适用于样品列，离心1分钟〜13000。清空收集管。
- 要洗净，加0.75 mL缓冲液PE（QIAGEN提供）1分钟〜13000列和离心机。
- 重复步骤4。
- 空集合管和离心机以最大的速度增加1分钟的列。
- 地点列在一个干净的1.5 ml离心管，小心地加入30μl的缓冲液EB（QIAGEN提供）列膜的中心。
- 孵育1分钟室温。
- 1分钟〜13000 RPM离心洗脱。
- 重复第二次到同一管流出步骤7-9。最后的洗脱体积应〜60μL。
标记反应分析
在这个阶段可以量化的cDNA量和标签：
- 测量外径260，550和650（空白是水。）使用nanodrop的芯片方案。
- 计算pmol染料掺入pmol的DNA与国统会/染料的比例给予下面公式：
pmol核苷酸= [OD260 *量（μl）* 37毫微克/μL* 1000皮克/ NG] / 324.5 PG / pmol
注 ：1 OD260 = 37纳克/μLcDNA的; 324.5 pg / pmol的一个dNTP的平均分子量）
pmol Cy3标记= OD550 *量（μl）/ 0.15
pmol Cy5的量（μl）/ 0.25 = OD650
核苷酸/染料比率= pmol的cDNA / pmol赛扬染料
如果您正在使用nanodrop的，它已经给每个染料pmol /μL。你只需要这个数字乘以数量得到总pmol染料掺入。
注 ：> 150-200 pmol染料掺入每个样品的比例小于20个核苷酸/染料分子杂交的最佳选择。
- 在黑暗的样品可以储存在-20 ° C。
- 结合探针杂交在一起，干倒在SpeedVac在42 ° C。
- 样品可以储存在-20 ° C，直到准备来HYB。
前HYB幻灯片
- 放置滑面，跌幅超过RT 100毫升水3-5分钟，在一个干净的红色幻灯片持有人
- 对齐干，放置在100℃加热块面对几秒钟的幻灯片 - 手表凝结消失
- 紫外光交联在250 mJoules幻灯片（紫外线交联剂输入2500）
- 预热42℃的热水中浸渍水合物的幻灯片。旋转700 RPM在室温5分钟。
- 孵育于50ml Coplin JAR幻灯片包含至少45分钟的预热预HYB（5XSSC，1％BSA，0.1％SDS）@ 42 ° C，并且潜伏期可以去如果必要的时间。
50毫升HYB前缓冲区：12.5毫升20X SSC，10毫升5％BSA，0.5毫升10％SDS，27 mL水 - DIP幻灯片和预热水（42℃）搅拌几分钟删除前HYB缓冲区。
- 异丙醇冲洗和旋转700 RPM，室温，干燥5分钟。
准备样品杂交
- 悬浮在水中的探头（卷下面给出）
对于总卷。 =30μl 对于总卷。 =35μl 总卷.=40μl 19.8μL水 23.55μL水 27.2μL水 1.5μL 1.5μL 1.5μL 10毫克/毫升的鲑鱼精子DNA（Invitrogen公司） 1.2μL 1.2μL 1.2μL 12.5毫克/毫升的tRNA 4.5μL 5.25μL 6μL 20XSSC（3X最后） 3μL 3.5μL 4μL 1％SDS
注 ：此外试剂的顺序是很重要的。不要准备预混。 - 煮沸5分钟，然后旋转14000转5分钟。室温2分钟冷却。
杂交
- 加入10-12μl的3倍SSC的每个边缘和中间的杂交室井。
- 添加清洁升降机滑幻灯片的适当区域，并在杂交液轻轻加载（30 -40μL）。应该有额外的样品任盖玻片边缘。
- 放置在会议厅内的幻灯片。拧紧螺钉和地方在65℃水浴过夜。不要直接放在水浴底部的腔。至上腔顶部放置一个块保存一切就绪。继续水浴盖子保护光敏感的样品。
HYB洗
- 准备以下的缓冲区：
- 1X SSC，0.05％SDS
- 0.06 X SSC
- 孵化后启封杂交室。从试验箱中取出的幻灯片，小心不要打扰盖玻片。
- 要删除盖玻片，淹菜中含有温暖1X SSC，0.05％SDS的缓冲液洗盖玻片面临的菜底部的幻灯片。盖玻片会脱落移动幻灯片一边到另一边。
- 盖玻片后取出，放置在一个温暖1XSSCm 0.05％SDS的机架新鲜浴的幻灯片。鼓动几分钟
- 将幻灯片加上机架0.06 X SSC洗澡。
- 幻灯片传输到另一个BA日的0.06 X SSC包含一个新的机架，在纸巾上的印迹幻灯片之前删除尽可能多的SDS含缓冲区尽可能放置在新鲜浴。
- 搅拌几分钟的幻灯片。
- 立即在室温下自旋为5分钟700转，然后幻灯片准备扫描。商店在黑暗中，直到扫描。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AA-dUTP | Sigma-Aldrich | A0410 | 5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate | |
| dNTP | Amersham | 27-2035-01 | 100 mM dNTP Set PCR grade | |
| Random Hexamer primers | Amersham | 27-2166-01 | 3mg/mL | |
| SuperScript III RT | Invitrogen | 80800444 | 200U/μL | |
| CyDye™ | Amersham | RPN5661 | Post-Labelling Reactive Dye Pack | |
| QIAquick | Qiagen | 28104 | PCR Purification kit | |
| 1 M K2HPO4 | ||||
| 1 M KH2PO4 | ||||
| 1 M KPO4 | Buffer | To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4 | ||
| Phosphate wash buffer | Buffer | For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily. | ||
| Phosphate elution buffer | Buffer | Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water | ||
| Sodium Carbonate Buffer | (Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month. |
References
- Hasseman, J. TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for. Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.
- Gilbert,, et al. TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels. , Forthcoming.
- Hedge,, et al. A concise guide to cDNA Microarray analysis-II. , Forthcoming.
