Gene Expression חיידקית ניתוח שימוש microarrays

Summary

Protocol

היפוך תגובה transcriptase

הפעל לחסום חימום 70-80 מעלות צלזיוס, 42 ° C. אמבטיות מים יכול לשמש גם בשלב זה. אם אתה משתמש חוסם חימום, לשים קצת מים, כך החום הוא אחיד.

1. תחול תגובה
   1. קח 3 מיקרוגרם של רנ"א
   2. התאם את עוצמת הקול μl 13 עם מים חינם RNase
   3. הוספת 2.5 μl של אקראיות hexamer primers (2mg/mL)
2. מערבבים היטב לדגור על 70-80 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. ואז, במקום על קרח למשך 5 דקות.
3. הכינו קוקטייל RT (14.5 μl / rxn):
   
   

   רכיב	נפח
   5X סטרנד ראשון חיץ	6 μl
   0.1 מ DTT	3 μl
   לערבב 25X aminoallyl-dNTP	1.2 μl
   עילי ב RT (200U/μl)	2.3 μl
   מים	2.0 μl

   
   * לקבלת תגובות n, להכין מיקס מאסטר עבור n 0.5 aliquots של קוקטייל להבטיח כי אתה לא ייגמר.
   
   
4. הוסף μl 14.5 לתגובות מקורר.
5. מערבבים (לא מערבולת) ו לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך 3-4 שעות
6. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C במידת הצורך.

Hydrolyze RNA

1. כדי מדגם זה, להוסיף 3 μl של 1 N NaOH ו 0.6 μl של 0.5 M EDTA. (סופי conc.s = NaOH 100mm, 10mm EDTA)
2. מערבבים לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
3. לנטרל על ידי הוספת 33.6 HEPES 1M μl, pH = 7.0 (הסופי קונצרט כלשהו .= HEPES 500mm)
4. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C, במידת הצורך.

טיהור התגובה: הסרת מאוגדים aa-dUTP ו אמינים חינם

הערה: פרוטוקול הטיהור הוא שונה מן הפרוטוקול QIAquick Qiagen PCRpurification הערכה. לשטוף את פוספט מאגרים elution מחליפים מאגרים Qiagen מסופק כי מאגרים Qiagen מכילים אמינים חופשי להתחרות עם תגובת הצימוד סיי לצבוע. העמודות מתיק מיני הכנה יכול לשמש גם.

1. מערבבים התגובה cDNA עם μl 300 (או נפח תגובה 5X = 336 μl) חיץ PB (Qiagen מסופק) ולהעביר לטור QIAquick.
2. מניחים את הטור בצינור אוסף 2 מ"ל (Qiagen מסופק) ו - 13,000 צנטריפוגות בסל"ד ~ דקה 1. אוסף שפופרת ריק.
3. כדי לשטוף, להוסיף 750 פוספט μl לשטוף חיץ (לא של Qiagen) לעמודה ו צנטריפוגות בסל"ד 13,000 ~ דקה 1.
4. רוקן את צינור איסוף לחזור על לשטוף μl 750 צעד צנטריפוגה.
5. רוקן את צינור איסוף צנטריפוגות העמודה 1 דקה נוספת במהירות המרבית.
6. העברת עמודה צינור חדש mL 1.5 microfuge בזהירות להוסיף 30 חיץ μl elution פוספט. (ראה סעיף פתרון הכנה)
7. דגירה דקה 1 בטמפרטורת החדר.
8. Elute ידי צנטריפוגה בסל"ד 13,000 ~ דקה 1.
9. Elute בפעם השנייה (עם עוד 30 μl של חיץ elution פוספט) לתוך הצינור אותו על ידי חזרה על שלבים 6-8. נפח elution הסופי צריך להיות ~ 60 μl.
10. כמות cDNA ניתן לכמת בשלב זה:
    ng cDNA = (גורם לדילול) (OD260) (37) (הנפח הכולל eluted מהעמודה)
11. מדגם יבש במהירות VAC ב 45 ° C.
12. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C במידת הצורך.

צימוד aa-cDNA לסי אסתר דיי

1. Resuspend aminoallyl שכותרתו cDNA עם 10 μl pH 50 מ"מ, Na-ביקרבונט = 9.0 במידת הצורך. (זה חוצץ צריכה להיעשות טרי לשבועיים)
2. עבודה במקום חשוך, מוסיפים את החללית אל שפופרת של צבע סיי המתאים. Pipet למעלה ולמטה כמה פעמים resuspend לצבוע.
3. דגירה התגובה לשעה 1 בחושך בטמפרטורת החדר. (דגירה יכול ללכת עד שעתיים)

טיהור התגובה השנייה: הסרת צבע זוגיים

1. כדי להוסיף את תגובת 35 מ"מ μl 100 NaOAc pH 5.2. מערבבים היטב.
2. הוסף 250 μl (או נפח תגובה 5X = 225 μl) הצפת PB (Qiagen מסופק) לדגום כל ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה.
3. המקום טור ספין QIAquick בצינור אוסף 2 מ"ל (Qiagen מסופקת), להחיל את המדגם כדי הטור, ו צנטריפוגות ב ~ 13,000 דקה 1. אוסף שפופרת ריק.
4. כדי לשטוף, להוסיף 0.75 מ"ל הצפת PE (Qiagen מסופק) לעמודה ו צנטריפוגות ב ~ 13,000 דקה 1.
5. חזור על שלב 4.
6. אוסף שפופרת ריק ועמודה צנטריפוגות במשך דקה 1 נוסף במהירות המרבית.
7. בעמודה מקום צינור נקי mL 1.5 microfuge בזהירות להוסיף 30 הצפת EB μl (Qiagen מסופק) למרכז הממברנה העמודה.
8. דגירה דקה 1 בטמפרטורת החדר.
9. Elute ידי צנטריפוגה בסל"ד 13,000 ~ דקה 1.
10. Elute בפעם השנייה לתוך הצינור אותו על ידי חזרה עלצעדים 7-9. נפח eluted הסופי צריך להיות ~ 60 μl.

ניתוח של תגובת תיוג

כמות cDNA ו תווית ניתן לכמת בשלב זה:

• מדידת OD 260, 550 ו - 650 (בלנק הוא מים.) השתמש בתוכנית microarray nanodrop.
• חישוב pmol ההתאגדות צבעים ו-DNA ו nuc pmol / צבע יחס עם משוואות כדלקמן:
  
  נוקלאוטידים pmol = [OD260 * נפח (μL) * 37 ng / μL * 1000 pg / ng] / 324.5 pg / pmol

הערה: 1 OD260 = 37 ng / μL עבור cDNA: 324.5 pg / pmol משקל מולקולרי ממוצע של dNTP)
pmol Cy3 OD550 = נפח * (μL) / 0.15
pmol Cy5 OD650 = נפח * (μL) / 0.25
נוקלאוטידים / יחס לצבוע = cDNA pmol / pmol סיי צבע

אם אתה משתמש nanodrop, זה כבר נותן pmol / μl עבור כל צבע. אתה רק צריך להכפיל את המספר הזה על ידי היקף לקבל צבע מסך ההתאגדות pmol.

הערה:> 150-200 pmol ההתאגדות לכל צבע מדגם יחס של פחות מ -20 נוקלאוטידים / מולקולות צבען הוא אופטימלי עבור הכלאות.

• דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C עם חשיכה.
  • שלב בדיקות להיות הכלאה יחד ויבש למטה speedvac ב 42 ° C.
  • דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C עד מוכן hyb.

קדם שקופיות hyb

1. להחליק מטה על פני המקום RT 100 מ"ל מים מחזיק שקופיות נקי אדום עבור 3-5 דקות
2. הצמד יבש השקופית ידי הצבת להתמודד על בלוק 100 מעלות צלזיוס חימום למשך כמה שניות - להיזהר עיבוי להיעלם
3. UV צולבות הקישור לשקופית ב 250 mJoules (הזן 2500 כדי crosslinker UV)
4. מגלשות מימה ידי טבילה מראש חיממו מים 42 מעלות צלזיוס. ספין 5 דק 'ב 700 סל"ד ב RT.
5. מגלשות דגירה בצנצנת המכילה 50 מ"ל Coplin מראש חימם מראש hyb (5XSSC, BSA 1%, 0.1% SDS) לפחות 45 דקות @ 42 ° C, ו הדגירה יכול להימשך זמן רב יותר במידת הצורך.
   
   50 מ"ל חיץ מראש hyb: 12.5 מ"ל 20x SSC, 10 מ"ל BSA 5%, 0.5 מ"ל SDS 10%, 27 מ"ל מים
   
   
6. טובלים מגלשות מים מראש התחמם (42 ° C) להתסיס כמה דקות כדי להסיר מראש hyb חיץ.
7. יש לשטוף ב isopropanol ספין 5 דקות על 700 סל"ד, טמפ 'החדר, להתייבש.

דגימות הכנה הכלאה

1. בדיקה Resuspend במים (כרכים הם כדלקמן)
   
   

   במשך כרך הכולל. = 30μl	במשך כרך הכולל. = 35μl	עבור סך כרך .= 40μl
   19.8 μl מים	23.55 μl מים	27.2 μl מים
   1.5 μl	1.5 μl	1.5 μl	10 מ"ג / מ"ל ​​זרע סלמון DNA (Invitrogen)
   1.2 μl	1.2 μl	1.2 μl	12.5 מ"ג / מ"ל ​​tRNA
   4.5 μl	5.25 μl	6 μl	20XSSC (סופי 3X)
   3 μl	Μl 3.5	4 μl	1% SDS

   
   הערה: הסדר של תוספת של חומרים כימיים חשובים. אין להכין תערובת מאסטר.
   
   
2. מרתיחים במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסתובב 5 דקות ב 14,000 סל"ד. מגניב 2 דקות על טמפ החדר.

הכלאה

1. הוסף 10-12 μl של 3X SSC אל הבארות של החדר הכלאה על קצה כל באמצע.
2. הוספת להחליק מרים נקי לאזור המתאים של השקופית בעדינות לטעון פתרון הכלאה (30 -40 μl). לא צריך להיות מדגם נוסף על קצה אחד להחליק את המכסה.
3. מניחים את החלק בתא. הדקו את הברגים ומניחים אמבטיה 65 מעלות צלזיוס מים למשך הלילה. אין למקם את חדר ישירות על תחתית האמבטיה במים. מניחים בלוק על גבי תא עליון להחזיק הכל במקום. שמור את המכסה על אמבט מים כדי להגן על דגימות רגיש לאור.

Hyb רוחצת

1. הכן את החוצצים הבאים:
   • 1X SSC, SDS 0.05%
   • 0.06 X SSC
2. לאחר קאמרית הכלאה unseal הדגירה. הסר את השקופית מן החדר, נזהרת שלא להפריע coverslip.
3. כדי להסיר coverslips, מגלשות לצלול בצלחת המכילה חם 1X SSC, 0.05% SDS coverslip לשטוף חיץ מול התחתון של המנה. Coverslip תיפול על ידי הזזת לצד שקופית לצד.
4. לאחר coverslip מוסר, במקום להחליק במעמד אמבטיה חמה עם טרי 1XSSCm SDS 0.05%. להתסיס במשך כמה דקות
5. העברת שקופיות בתוספת מתלה לאמבטיה של 0.06 X SSC.
6. העברת שקופיות תואר ראשון אחרה של 0.06 X SSC המכיל מתלה טריים, סופג את השקופית על מגבת נייר כדי להסיר כמה SDS המכילים חיץ ככל האפשר לפני הצבת באמבטיה טריים.
7. להתסיס שקופיות במשך כמה דקות.
8. ספין מיד בטמפרטורת החדר למשך 5 דק '700 סל"ד @, אז שקופיות מוכנים לסריקה. חנות בחושך עד סרוקות.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer	Buffer			For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer	Buffer			Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.