Summary
Protocol
Transcriptase 반응을 역방향
70-80로 가열 블록 돌려 ° C 42 ° C. 워터 온천도이 단계에서 사용할 수 있습니다. 가열 블록을 사용하는 경우, 열이 균일되도록 물을 넣어.
- 마중물 반응
- RNA 3 μg을 가지고
- RNase 무료 물을 13 μl로 볼륨을 조정
- 랜덤 hexamer primers (2mg/mL) 2.5 μl 추가
- 잘 믹스 8 분 동안 70-80 ° C에서 알을 품다. 5 분 얼음 그런 다음, 장소.
- : RT 칵테일 (14.5 μl / rxn) 준비
구성 요소 음량 배 첫 스트랜드 버퍼 6 μl 0.1 M DTT 3 μl 25X aminoallyl - dNTP 믹스 1.2 μl 윗첨자 II RT (200U/μl) 2.3 μl 물 2.0 μl
* N 반응의 경우, 밖으로 실행되지 않습니다 보증하기위한 칵테일 N 0.5 aliquots에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. - 냉각 반응 14.5 μl를 추가합니다.
- 혼합 (와동하지 않음)과 ° C 3-4시간에 대한 42 알을 품다
- 필요한 경우 샘플은 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
Hydrolyze RNA
- 각 샘플하려면, 1 N NaOH 3 μl와 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.6 μl를 추가합니다. (최종 conc.s = 100mM NaOH, 10mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))
- 믹스 65에서 품어 ° C를 10 분.
- 33.6 μl 1M HEPES를 추가하여 중화, 산도 = 7.0 (최종 CONC .= 500mM의 HEPES)
- 샘플이 필요한 경우, -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
반응 정제 : 비법인 AA - dUTP의 제거와 무료 아민
참고 :이 정화 프로토콜은 Qiagen QIAquick의 PCRpurification 키트 프로토콜에서 수정됩니다. Qiagen 버퍼가 싸이 염료 커플링 반응과 경쟁 무료 아민을 포함하기 때문에 인산염 세척 및 용출 버퍼는 Qiagen 제공된 버퍼에 대한 대체됩니다. 미니 준비 키트에서 열이도 사용할 수 있습니다.
- 300 μl (또는 배 반응 볼륨 = 336 μl) 버퍼 PB (Qiagen 공급)와 cDNA 반응을 믹스하고 QIAquick 열로 전송할 수 있습니다.
- 2 ML 수집 관에서 열 (Qiagen 공급)을 놓고 1 분 ~ 13,000 rpm으로 원심 분리기. 빈 컬렉션 튜브.
- 세척하려면 1 분 ~ 13,000 rpm으로 열 및 원심을 750 μl 인산염 세척 버퍼 (안 Qiagen의)을 추가합니다.
- 수집 튜브를 비우기와 750 μl 세척과 원심 분리의 단계를 반복합니다.
- 수집 튜브를 비우기 및 열에게 최대 속도에서 추가로 1 분 원심 분리기.
- 새로운 1.5 ML의 microfuge 튜브에 열을 전송 조심스럽게 30 μl 인산 용출 버퍼를 추가합니다. (솔루션 준비 부분을 참조)
- 실온에서 1 분 알을 품다.
- 1 분 ~ 13,000 rpm으로 원심 분리에 의해 Elute.
- 반복 단계 6-8하여 동일한 튜브에 두 번 (인산 용출 버퍼의 다른 30 μl)를 Elute. 최종 용출 량 ~ 60 μl해야합니다.
- cDNA의 양은이 단계에서 계량 수 있습니다 :
NG cDNA = (희석 계수) (OD260) (37) (총 볼륨이 칼럼에서 eluted) - 45 VAC 속도 드라이 샘플 ° C.
- 필요한 경우 샘플은 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
다이 에스터을 싸이에 AA - cDNA 커플링
- Resuspend 10 μl 50 MM 나 - 중탄산염, 산도 = 9.0 필요한 경우와 cDNA aminoallyl - 분류. (이 버퍼가 격주 신선한하여야한다)
- 어두운 장소에서 작업, 해당 싸이의 염료의 튜브에 프로브를 추가합니다. Pipet 위아래로 여러 번은 염료를 resuspend 수 있습니다.
- 상온에서 어둠 속에서 1 시간 동안 반응을 품어. (부화 최대 2 시간이 갈 수 있습니다)
반응 정제 II : uncoupled 염료의 제거
- 반응 35 μl 100 MM NaOAc의 산도 5.2을 추가합니다. 완전히 섞는다.
- 250 μl 추가 (또는 배 반응 볼륨을 = 225 μl) 버퍼 각각의 샘플 및 최대 pipetting 아래로 섞어 PB (Qiagen 공급).
- 2 ML 수집 관에 QIAquick의 스핀 컬럼 (Qiagen 공급)을 장소, 그 결과 해당 컬럼에 대한 샘플을 신청하고, 1 분 ~ 13,000에서 원심 분리기. 빈 컬렉션 튜브.
- 세척하려면 1 분 ~ 13,000에서 열 및 원심 분리기에 0.75 ML 버퍼 PE를 (Qiagen 제공)을 추가합니다.
- 4 단계를 반복합니다.
- 빈 수집 튜브와 최대 속도로 추가 1 분 원심 분리기 칼럼.
- 신중하게 플레이스 깨끗한 1.5 ML의 microfuge 튜브의 열 및 열 막의 중심 30 μl 버퍼 EB을 (Qiagen 제공)을 추가합니다.
- 실온에서 1 분 알을 품다.
- 1 분 ~ 13,000 rpm으로 원심 분리에 의해 Elute.
- 반복하여 동일한 튜브에 두 번 Elute단계 7-9. 최종 eluted 볼륨 ~ 60 μl해야합니다.
라벨링 반응 분석
cDNA의 금액과 레이블은이 단계에서 계량 수 있습니다 :
- OD 260, 550 및 650 (빈 물을 수 있습니다.) nanodrop microarray 프로그램을 사용을 측정합니다.
- 염료의 설립 및 아래 방정식과 pmol DNA와 염료 / nuc 비율 pmol을 계산할 수 :
pmol의 세포핵 = [OD260 * 볼륨 (μL) * 37 μL / NG * 1000 PG / NG] / 324.5 PG / pmol
주 : 1 OD260 cDNA를 위해 = 37 NG / μL, dNTP의 324.5 PG / pmol 평균 분자량)
pmol Cy3 = OD550 * 볼륨 (μL) / 0.15
pmol Cy5 = OD650 * 볼륨 (μL) / 0.25
세포핵 / 염색 비율 = pmol pmol / cDNA 싸이 염료
당신이 nanodrop를 사용하는 경우, 이미 μl / pmol의 각 색소 있습니다. 당신은 전체 pmol 염료의 설립을 위해 볼륨을하여이 수를 모두 곱하면해야합니다.
참고 :> 염료 샘플 당 정관 이하 20 세포핵 / 염료 분자의 비율은 150-200 pmol가 hybridizations 최적입니다.
- 샘플은 암흑에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 함께 hybridized하는 프로브를 결합하고 42 speedvac 아래로 건조 ° C.를
- 샘플은 hyb 준비 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
사전 hyb 슬라이드
- 3~5분을위한 깨끗한 빨간색 슬라이드 홀더에 넣어 슬라이드 땅에 얼굴 RT 100 ML 물
- 몇 초 동안 100 ° C 가열 블록에 얼굴을 배치하여 슬라이드를 건조 스냅 - 결로가 사라져 위해 감시
- 250 mJoules에서 UV는 상호 링크 슬라이드 (UV crosslinker에 2500 입력)
- 사전 예열 42 ° C의 물 속에서 수영의 수화물 슬라이드. RT에서 700 rpm으로 5 분 스핀.
- 필요한 경우 적어도 45 분 동안 미리 예열 사전 hyb (5XSSC, 1 % BSA, 0.1 % SDS)를 포함 50ml 코플린있는 항아리에 품어 슬라이드는 @ 42 ° C, 그리고 부화 더 오래 갈 수 있습니다.
50 ML 사전 hyb 버퍼 : 12.5 ML 20x SSC, 10 ML 5% BSA, 0.5 ML 10% SDS, 27 ML 물 - 딥 사전 예열 물 (42 ° C)에서 슬라이드와 사전 hyb 버퍼를 제거하는 몇 분을 선동하다.
- 이소프로판올에 씻어 700 RPM, 온도는 실온, 건조시 5 분 스핀.
하이브 리다이 제이션 준비 샘플
- 물에 Resuspend의 프로브 (볼륨이 아래에 있습니다)
총 권하십시오. = 30μl 총 권하십시오. = 35μl 총 권 .= 40μl에 대한 19.8 μl 물 23.55 μl 물 27.2 μl 물 1.5 μl 1.5 μl 1.5 μl 10 MG / ML 연어 정자 DNA (Invitrogen) 1.2 μl 1.2 μl 1.2 μl 12.5 MG / ML tRNA 4.5 μl 5.25 μl 6 μl 20XSSC (배 최종) 3 μl μl 3.5 4 μl 1퍼센트 SDS
참고 : 시약의 이외의 순서가 중요합니다. 마스터 믹스를 준비하지 마십시오. - 5 분 삶아 후 14,000 rpm으로 5 분만 스핀. 온도는 실온에서 2 분 쿨.
이종 교잡
- 각 모서리와 중앙에 하이브리드화 챔버의 우물에 배 SSC의 10-12 μl를 추가합니다.
- 슬라이드의 해당 영역에 깨끗한 리프터 전표를 추가하고 부드럽게 (30 -40 μl) 하이브 리다이 제이션 솔루션에로드합니다. 커버 슬립 중 하나를 가장자리에 여분의 샘플이 있어야합니다.
- 챔버에있는 슬라이드를 놓습니다. 하룻밤 65 ° C 물 목욕에있는 나사와 장소를 조이십시오. 물 목욕의 바닥에 직접 챔버을 올려 놓지 마십시오. 장소에 모든 잡아 맨 위에 챔버 위에 블록을 배치합니다. 빛을 민감한 샘플을 보호하기 위해 물을 욕조에 뚜껑을 유지.
Hyb은 세척
- 다음 버퍼를 준비 :
- 1X SSC, 0.05 % SDS
- 0.06 X SSC
- 부화 풀어봐 하이브리드화 챔버 후. coverslip을 방해하지 않도록 돌봐, 챔버에서 슬라이드를 제거합니다.
- coverslips을 제거하려면, 따뜻한 1X SSC, 접시의 바닥을 향하고 0.05 % SDS 세척 버퍼 coverslip을 포함 접시에 잠수함 슬라이드. coverslip는쪽으로 슬라이드 사이드를 이동하여 떨어질 것입니다.
- coverslip가 제거되면 따뜻한 1XSSCm 0.05 % SDS와 랙 신선한 목욕탕에서 슬라이드를 놓으십시오. 몇 분 동안 선동
- 0.06 X SSC의 목욕에 슬라이드 플러스 랙을 전송합니다.
- 다른 바로 슬라이드를 전송0.06 X SSC는 신선한 욕조에 넣어 전에 가능한 한 많은 SDS - 포함된 버퍼를 제거하는 종이 타월에있는 슬라이드를 모래 바닥, 신선한 랙을 포함의 일.
- 몇 분 동안 슬라이드를 선동.
- 5 분 @ 700 RPM에 상온에서 바로 스핀, 그리고 슬라이드는 스캔 준비가되었습니다. 스캔까지 어둠 속에 보관하십시오.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AA-dUTP | Sigma-Aldrich | A0410 | 5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate | |
| dNTP | Amersham | 27-2035-01 | 100 mM dNTP Set PCR grade | |
| Random Hexamer primers | Amersham | 27-2166-01 | 3mg/mL | |
| SuperScript III RT | Invitrogen | 80800444 | 200U/μL | |
| CyDye™ | Amersham | RPN5661 | Post-Labelling Reactive Dye Pack | |
| QIAquick | Qiagen | 28104 | PCR Purification kit | |
| 1 M K2HPO4 | ||||
| 1 M KH2PO4 | ||||
| 1 M KPO4 | Buffer | To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4 | ||
| Phosphate wash buffer | Buffer | For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily. | ||
| Phosphate elution buffer | Buffer | Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water | ||
| Sodium Carbonate Buffer | (Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month. |
References
- Hasseman, J. TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for. Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.
- Gilbert,, et al. TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels. , Forthcoming.
- Hedge,, et al. A concise guide to cDNA Microarray analysis-II. , Forthcoming.
