Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Summary

Protocol

Reação reversa Transcriptase

Vire bloco de aquecimento a 70-80 ° C e 42 ° C. Banhos de água também pode ser usado nesta etapa. Se estiver usando blocos de aquecimento, coloque um pouco de água para que o calor é uniforme.

1. Reação priming
   1. Tome 3 mg de RNA
   2. Ajustar o volume para 13 mL com água livre de RNase
   3. Adicionar 2,5 mL de aleatório hexâmero primers (2mg/ml)
2. Misturar bem e incubar a 70-80 ° C por 8 minutos. Em seguida, coloque, em gelo por 5 min.
3. Prepare RT cocktail (14,5 mL / rxn):
   
   

   Componente	Volume
   Tampão 5X First Strand	6 mL
   0,1 M DTT	3 mL
   Mix dNTP aminoallyl-25X	1,2 mL
   SuperScript II RT (200U/μl)	2,3 mL
   Água	2,0 mL

   
   * Para as reacções n, prepare Mix Master de n 0,5 alíquotas de cocktail para garantir que você não vai acabar.
   
   
4. Adicionar 14,5 mL de reações resfriado.
5. Mix (não vortex) e incubar a 42 ° C por 3-4 horas
6. Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C, se necessário.

Hidrolisar RNA

1. Para cada amostra, adicionar 3 mL de NaOH 1 N e 0,6 mL de 0,5 M EDTA. (Final conc.s = NaOH 100mM, EDTA 10mM)
2. Misturar e incubar a 65 ° C por 10 minutos.
3. Neutralize adicionando 33,6 mL HEPES 1M, pH = 7,0 (final conc .= 500mM HEPES)
4. Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C, se necessário.

Purificação de reação: Remoção de unincorporated aa-dUTP e aminas livres

Nota: Este protocolo de purificação é modificado a partir da PCRpurification QIAquick Qiagen protocolo kit. A lavagem de fosfato e buffers de eluição são substituídos pela Qiagen buffers fornecidos porque os buffers Qiagen contêm aminas livres que competem com a reação de acoplamento Cy corante. As colunas do kit de mini-prep também pode ser usado.

1. Mistura de reacção cDNA com 300 ml (ou volume de reação 5X = mL 336) tampão PB (Qiagen fornecido) e transferir para a coluna QIAquick.
2. Coloque a coluna em um tubo de coleta de 2 ml (Qiagen fornecido) e centrifugar a 13.000 rpm ~ por 1 minuto. Tubo de coleta vazio.
3. Para lavar, adicionar 750 mL de fosfato tampão de lavagem (não Qiagen) para a coluna e centrifugar a 13.000 rpm ~ por 1 minuto.
4. Esvaziar o tubo de coleta e repetir a lavagem 750 mL e etapa de centrifugação.
5. Esvaziar o tubo de coleta e centrifugar a coluna um adicional de 1 minuto na velocidade máxima.
6. Transferência da coluna para um novo microtubo de 1,5 mL e com cuidado, 30 mL de fosfato tampão de eluição. (Ver secção preparação da solução)
7. Incubar por 1 minuto à temperatura ambiente.
8. Eluir por centrifugação a 13.000 rpm ~ por 1 minuto.
9. Eluir uma segunda vez (com outra mL 30 de tampão de eluição fosfato) no mesmo tubo, repetindo as etapas 6-8. O volume de eluição final deve ser ~ 60 mL.
10. A quantidade de cDNA podem ser quantificados nesta fase:
    ng cDNA = (fator de diluição) (OD260) (37) (volume total eluído da coluna)
11. Amostra seca em uma velocidade vac a 45 ° C.
12. Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C, se necessário.

Acoplamento aa-cDNA para Cy Ester Dye

1. Ressuspender aminoallyl marcado cDNA com 10 ml 50 mM bicarbonato de sódio, pH = 9,0, se necessário. (Esta reserva deve ser feita nova a cada duas semanas)
2. Trabalhando em um lugar escuro, adicione a sonda a um tubo do corante Cy apropriado. Pipeta para cima e para baixo várias vezes para voltar a suspender o corante.
3. Incubar a reação de uma hora no escuro à temperatura ambiente. (Incubação pode ir até duas horas)

Purificação reação II: Remoção de corante desacoplado

1. À reação 35 mL adicionar 100 mM pH 5,2 NaOAc. Misture bem.
2. Adicionar 250 mL (ou volume de reação 5X = 225 mL) Buffer PB (Qiagen fornecido) para cada amostra e misture pipetando para cima e para baixo.
3. Coloque a coluna QIAquick em um tubo de coleta de 2 mL (Qiagen fornecido), aplicam-se a amostra para a coluna, e centrifugar a ~ 13.000 para 1 minuto. Tubo de coleta vazio.
4. Para lavar, adicionar 0,75 mL de tampão PE (Qiagen fornecido) para a coluna e centrifugar a ~ 13.000 para 1 minuto.
5. Repita o passo 4.
6. Tubo de coleta vazio e coluna centrífuga para um 1 minuto adicional na velocidade máxima.
7. Coloque em uma coluna limpa microtubo de 1,5 mL e adicionar 30 mL cuidadosamente tampão EB (Qiagen fornecido) para o centro da membrana da coluna.
8. Incubar por 1 minuto à temperatura ambiente.
9. Eluir por centrifugação a 13.000 rpm ~ por 1 minuto.
10. Eluir pela segunda vez no mesmo tubo, repetindopassos 7-9. O volume final deve ser eluída ~ mL 60.

Análise da reação de Rotulagem

A quantidade de cDNA e etiqueta pode ser quantificado nesta fase:

• Medida OD 260, 550 e 650 (em branco é a água.) Use o programa microarray nanodrop.
• Calcular o pmol de corantes incorporação e DNA pmol e nuc / corante relação com as equações abaixo:
  
  nucleotídeos pmol = [OD260 * volume (mL) * 37 ng / mL * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol

Nota: 1 OD260 = 37 ng / mL para cDNA; 324,5 pg / pmol peso molecular médio de um dNTP)
pmol Cy3 OD550 = volume * (mL) / 0,15
pmol Cy5 = OD650 * volume (mL) / 0,25
nucleotídeos / relação dye = cDNA pmol / pmol Cy dye

Se você estiver usando nanodrop, já dá pmol / mL para cada corante. Você só precisa multiplicar esse número por volume para obter a incorporação de corantes totais pmol.

Nota:> 150-200 pmol de incorporação de corante por amostra e uma proporção de menos de 20 nucleotídeos / moléculas de corante é ideal para hibridizações.

• Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C no escuro.
  • Combine sondas a ser hibridizado juntos e seco no speedvac a 42 ° C.
  • Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até estar pronto para hyb.

Pré-hyb slides

1. Slides lugar rosto para baixo sobre RT 100 mL de água em um suporte de lâmina limpa vermelha por 3-5 minutos
2. Encaixe a lâmina seca, colocando a face para cima em um bloco de aquecimento 100 ° C por alguns segundos - relógio para a condensação de desaparecer
3. UV ligação transversal a lâmina de 250 mJoules (Digite 2500 para o reticulador UV)
4. Slides hidratar por imersão em pré-aquecido a água 42 C °. Spin-5 min a 700 RPM na RT.
5. Slides incubar em jarra de Coplin 50ml contendo pré-aquecido pré-hyb (5XSSC, BSA 1%, 0,1% SDS) para pelo menos 45 minutos @ 42 ° C, e de incubação pode ir mais longe, se necessário.
   
   50 buffer de pré-hyb mL: 12,5 mL 20x SSC, 10 ml BSA 5%, 0,5 ml SDS 10%, 27 mL de água
   
   
6. Dip slides na pré-aquecido a água (42 ° C) e agitar um par de minutos para remover o pré-hyb buffer.
7. Enxágüe em isopropanol e spin 5 min a 700 rpm, temperatura ambiente, para secar.

Amostras preparando para a hibridização

1. Ressuspender sonda em água (volumes são apresentados abaixo)
   
   

   Para vol total. = 30μl	Para vol total. = 35μl	Para o total vol .= 40μl
   19,8 mL de água	23,55 mL de água	27,2 mL de água
   1,5 mL	1,5 mL	1,5 mL	10 mg / ml de DNA de esperma de salmão (Invitrogen)
   1,2 mL	1,2 mL	1,2 mL	12,5 mg / ml tRNA
   4,5 mL	5,25 mL	6 mL	20XSSC (final 3x)
   3 mL	3,5 mL	4 mL	1% SDS

   
   Nota: A ordem de adição dos reagentes são importantes. Não preparar mix master.
   
   
2. Ferva por 5 minutos, depois de spin 5 minutos a 14.000 rpm. Esfriar por 2 min à temperatura ambiente.

Hibridização

1. Adicionar 10-12 mL de 3X SSC aos poços da câmara de hibridação em cada ponta e no meio.
2. Adicionar um deslizamento levantador limpa para a área apropriada da lâmina e gentilmente carga em solução de hibridização (30 mL -40). Deve haver em cada amostra adicional borda da lamínula.
3. Coloque o slide na câmara. Aperte os parafusos e colocar em banho-maria a 65 ° C durante a noite. Não coloque a câmara diretamente sobre o fundo do banho-maria. Coloque um bloco no topo da câmara superior para manter tudo no lugar. Mantenha a tampa do banho de água para proteger as amostras sensíveis à luz.

Hyb Lava

1. Preparar os buffers seguinte:
   • SSC 1X, SDS 0,05%
   • 0,06 X SSC
2. Depois de a câmara de incubação de hibridação unseal. Remove o slide da câmara, tomando cuidado para não perturbar a lamela.
3. Para remover lamelas, lâminas de submergir em um prato quente contendo 1X SSC, 0,05% SDS lamela tampão de lavagem de frente para o fundo do prato. A lamela cairá movendo o lado deslize para o lado.
4. Após a lamínula é retirada, coloque o slide em um rack de um banho quente fresco com 1XSSCm SDS 0,05%. Agitar por alguns minutos
5. Transferência de slides mais rack para um banho de 0,06 X SSC.
6. Transferência de slides para outro baª de 0,06 X SSC contendo um rack novo, apagando o slide sobre um papel toalha para remover o máximo tampão contendo SDS-quanto possível antes de colocar no banho fresco.
7. Agitar slides para um par de minutos.
8. Girar imediatamente à temperatura ambiente por 5 min @ 700 rpm, em seguida, slides estão prontos para fazer a varredura. Loja no escuro até digitalizada.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer	Buffer			For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer	Buffer			Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.