Summary
Protocol
Ters Transcriptase Reaksiyon
70-80 ° C ve 42 ° C ısıtma bloğu açın Su banyoları da bu adımda kullanılabilir. Isıtma bloklar kullanılıyorsa, ısı tekdüze böylece biraz su koyun.
- Astar tepki
- RNA 3 mg alın
- 13 ul RNaz ücretsiz su ile ses seviyesini ayarlayın.
- Rastgele hexamer primerler (2mg/mL) 2.5 ul ekle
- İyice karıştırın ve 8 dakika 70-80 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, 5 dakika buz koyun.
- : RT kokteyl hazırlayın (14.5 ul / RXN)
Bileşen Hacim 5X İlk Strand tampon 6 ul 0.1 M DTT 3 ul 25X aminoallyl dNTP karışımı 1.2 ul Üst Simge II RT (200U/μl) 2.3 ul Su 2.0 ul
* N reaksiyonlar için tükendi sağlamak için kokteyl n 0,5 alikotları Master Mix hazırlamak. - Soğutmalı reaksiyonlar 14.5 ul ekleyin.
- Mix (vorteks) ve 42 ° C'de 3-4 saat inkübe
- Gerekirse örnekleri -20 ° C'de saklanabilir.
Hidroliz RNA
- Her bir örnek için, 1 N NaOH 3 ul ve 0,5 M EDTA 0.6 ul ekleyin. (Final conc.s = 100 mM NaOH, 10mM EDTA)
- Mix ve 65 ° C'de 10 dakika için.
- Nötralize 33.6 ul 1M Hepes ekleyerek, pH = 7.0 (son kons .= 500mm Hepes)
- Örnekleri, gerekirse, -20 ° C'de saklanabilir.
Reaksiyon Arıtma: adi aa-dUTP kaldırılması ve serbest aminler
Not: Bu arıtma protokolü Qiagen QIAquick PCRpurification kiti protokol değiştirilmiş. Qiagen tamponlar Cy boya kaplin reaksiyonu ile rekabet ücretsiz aminler içerdiğinden fosfat yıkama ve yıkama tamponları Qiagen sağlanan tamponlar yerine. Mini hazırlık kiti sütunları da kullanılabilir.
- 300 ul (veya 5X reaksiyon hacmi = 336 ul) tampon PB (Qiagen temin) ile cDNA reaksiyon karışımı ve QIAquick sütun transfer.
- 2 ml toplama tüpü sütun (Qiagen temin) koyun ve 1 dakika için ~ 13.000 rpm'de santrifüj. Boş toplama tüpü.
- Yıkamak için, sütun ve 1 dakika için ~ 13.000 rpm'de santrifüj 750 ul fosfat yıkama tamponu (değil Qiagen) ekleyebilirsiniz.
- Toplama tüpüne boşaltın ve 750 ul yıkama ve santrifüj basamağı tekrarlayın.
- Toplama tüpüne boşaltın ve sütun maksimum hızda bir ek 1 dakika santrifüj.
- Yeni bir 1.5 mL mikrofuge'de tüp sütun aktarın ve 30 ul fosfat elüsyon tampon dikkatlice ekleyin. (Çözelti hazırlama bölümüne bakınız)
- 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Için ~ 1 dakika 13.000 rpm'de santrifüj Zehir.
- Zehir adımları yineleyerek 6-8 ikinci kez aynı tüpe (30 ul fosfat elution tampon başka bir). Son elüsyon hacmi ~ 60 ul olmalıdır.
- CDNA miktarı bu aşamada sayısal olabilir:
ng cDNA = (seyreltme faktörü) (OD260) (37) (toplam hacmi sütun yıkandı,) - 45 vac hız Kuru örnek ° C
- Gerekirse örnekleri -20 ° C'de saklanabilir.
Boya Ester Cy aa-cDNA Kaplin
- Yeniden süspanse 10 ul 50 mM Na-bikarbonat, pH = 9.0 gerekirse cDNA aminoallyl etiketli. (Bu tampon her iki hafta taze yapılmalıdır)
- Karanlık bir yerde çalışmak, uygun Cy boya bir tüp prob ekleyin. Pipetleyin yukarı ve aşağı birkaç kez boya tekrar süspansiyon.
- 1 saat reaksiyon oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin. (Kuluçka iki saat kadar gidebilir)
Reaksiyon Arıtma II: Kuplajsız boya kaldırılması
- Reaksiyon için 35 ul 100 mM NaOAc pH 5.2 ekleyin. Iyice karıştırınız.
- 250 ul ekleme (veya 5X reaksiyon hacmi = 225 ul) Buffer her bir örnek ve yukarı ve aşağı pipetleme karışım PB (Qiagen temin)
- 2 ml toplama tüpüne bir QIAquick spin kolon (Qiagen temin) yerleştirin, sütun örnek uygulamak ve 1 dakika için ~ 13.000 santrifüj. Boş toplama tüpü.
- Yıkamak için, 1 dakika için ~ 13.000 kolon ve santrifüj 0.75 ml Tampon PE (Qiagen temin) ekleyin.
- 4. adımı yineleyin.
- Boş toplama tüpü ve ek olarak 1 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj sütun.
- Dikkatlice yerleştirin temiz bir 1.5 mL mikrofuge'de tüp, sütun ve sütun membran merkezine 30 ul Tampon EB (Qiagen temin) ekleyin.
- 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Için ~ 1 dakika 13.000 rpm'de santrifüj Zehir.
- Ikinci kez tekrar aynı tüpe Zehiradımları 7-9. Son yıkandı, hacmi ~ 60 ul olmalıdır.
Etiketleme Reaksiyon Analizi
CDNA miktarı ve etiket, bu aşamada sayısal olabilir:
- OD 260, 550 ve 650 (Boş sudur.) Nanodrop mikroarray programı kullanın ölçün.
- Boyalar dahil edilmesi ve aşağıda verilen denklemler ile pmol DNA ve boya / nük oranı pmol hesaplayın:
pmol nükleotidler = [OD260 * hacmi (mcL) * 37 ng / mcL * 1000 pg / ng / 324,5 pg / pmol
Not: 1 OD260 = cDNA için 37 ng / ml; bir dNTP 324,5 pg / pmol ortalama molekül ağırlığı)
pmol Cy3 = OD550 * hacmi (mcL) / 0.15
pmol Cy5 = OD650 * hacmi (mcL) / 0.25
nükleotidler / boya oranı = pmol pmol / cDNA Cy boya
Nanodrop kullanıyorsanız, zaten her boya için ul / pmol verir. Sadece toplam pmol boya birleştirmek için hacim itibariyle bu sayıyı çarpmak gerekir.
Not: boya dahil edilmesi ve örnek başına, 20'den az nükleotidler / boya molekülleri bir oran> 150-200 pmol döllemeler için en uygunudur .
- Örnekleri koyu -20 ° C'de saklanabilir.
- Birlikte melezleşmiştir probları birleştirin ve 42 speedvac kuru ° C
- Örnekler HYB için hazır olana kadar -20 ° C'de saklanabilir.
Pre-HYB slaytlar
- 3-5 dakika temiz bir kırmızı slayt tutucuya yerleştirin slayt yüzü aşağı RT üzerine 100 ml su
- Birkaç saniye için 100 ° C ısıtma bloğu yüzü yukarı yerleştirerek slayt kuru Snap - yoğunlaşma kaybolmaya izlemek
- 250 mJoules UV çapraz bağ slayt (UV çapraz bağlayıcı 2500 girin)
- Önceden ısıtılmış 42 ° C su daldırma Hidrat slaytlar. RT 700 RPM 5 dk Spin.
- Gerekirse en az 45 dakika önceden ısıtılmış ön-HYB (5XSSC,% 1 BSA,% 0.1 SDS) içeren 50ml Coplin kavanoza inkübe slaytlar @ 42 ° C ve inkübasyon uzun gidebilirsiniz.
50 ml-HYB ön tamponu: 12.5 ml 20x SSC, 10 ml% 5 BSA, 0.5 ml% 10 SDS, 27 ml su - Dip önceden ısıtılmış su (42 ° C) slaytlar ve HYB ön tampon kaldırmak için bir kaç dakika ajitasyon.
- Isopropanol durulayın ve 700 rpm, oda sıcaklığında, kuru 5 dakika döndürün.
Hibridizasyon için numunelerin hazırlanması
- Su içinde süspanse edin prob (birimler aşağıda verilmiştir)
Toplam vol. = 30μl Toplam vol. = 35μl Toplam vol .= 40μl 19.8 ul su 23.55 ul su 27.2 ul su 1.5 ul 1.5 ul 1.5 ul 10 mg / ml somon sperm DNA (Invitrogen) 1.2 ul 1.2 ul 1.2 ul 12.5 mg / ml tRNA 4,5 ul 5.25 ul 6 ul 20XSSC (3X son) 3 ul Ul 3.5 4 ul 1% SDS
Not: reaktiflerin ek sırası önemlidir. Ana karışımı hazırlamak etmeyin. - 5 dakika kaynatılır, sonra 14.000 rpm'de 5 dakika dönerler. 2 dakika süreyle oda sıcaklığında soğutun.
Melezleme
- Her kenar ve orta hibridizasyon odasının kuyulardan 3X DGM'nin 10-12 ul ekleyin.
- Slayt uygun bir alana, temiz bir kaldırıcı kayma ekleyin ve hafifçe hibridizasyon çözüm yük (30 -40 ul). Kapak kayma iki kenarında ekstra örnek olmalıdır.
- Odasında slayt yerleştirin. Bir gecede 65 ° C su banyosunda vida ve yer sıkın. Su banyosu alt doğrudan odasına koymayın. Her şeyi yerinde tutmak için en üst odasının üstünde bir blok yerleştirin. Işığa duyarlı örnekleri korumak için su banyosu kapağı tutun.
HYB yıkar
- Aşağıdaki tamponlar hazırlayın:
- 1X SSC,% 0.05 SDS
- 0.06 X SSC
- Inkübasyon mührünü kırmak hibridizasyon odasına sonra. Lamel rahatsız etmemek için özen slayt odasından çıkarın.
- Lamelleri kaldırmak için, sıcak 1X SSC, çanak alt bakan% 0.05 SDS yıkama tamponu lamel içeren bir tabak içinde batığın slaytlar. Lamel slayt yan tarafına hareket ettirerek kapalı düşecek.
- Lamel kaldırıldıktan sonra slayt, taze bir banyo, sıcak 1XSSCm% 0.05 SDS bir rafa koyun. Birkaç dakika için kışkırtıcılık
- 0.06 X SSC banyo slaytlar artı rafa aktarın.
- Slaytları başka bir ba aktarın0.06 X SSC, taze hamamı yerleştirmeden önce mümkün olduğunca çok SDS içeren tampon kaldırmak için bir kağıt havlu üzerine slayt blot, taze raf içeren th.
- Birkaç dakika için slaytlar çalkalayın.
- 5 dak 700 rpm için oda sıcaklığında hemen Spin, daha sonra slayt tarama için hazır. Taranan kadar karanlıkta saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AA-dUTP | Sigma-Aldrich | A0410 | 5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate | |
| dNTP | Amersham | 27-2035-01 | 100 mM dNTP Set PCR grade | |
| Random Hexamer primers | Amersham | 27-2166-01 | 3mg/mL | |
| SuperScript III RT | Invitrogen | 80800444 | 200U/μL | |
| CyDye™ | Amersham | RPN5661 | Post-Labelling Reactive Dye Pack | |
| QIAquick | Qiagen | 28104 | PCR Purification kit | |
| 1 M K2HPO4 | ||||
| 1 M KH2PO4 | ||||
| 1 M KPO4 | Buffer | To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4 | ||
| Phosphate wash buffer | Buffer | For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily. | ||
| Phosphate elution buffer | Buffer | Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water | ||
| Sodium Carbonate Buffer | (Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month. |
References
- Hasseman, J. TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for. Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.
- Gilbert,, et al. TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels. , Forthcoming.
- Hedge,, et al. A concise guide to cDNA Microarray analysis-II. , Forthcoming.
