Summary
본 논문에서 우리는 닭 배아의 중추 신경계의 여러 지역으로 인간의 줄기 세포를 이식하는 방법을 제시. 이것은을 제공합니다
Abstract
닭 배아는 표준에서 세포의 행동을 연구하기 위해 정상적인 배아와 태아의 개발 연구 및 xenotransplantation 실험에 대한 고전적인 동물 모델입니다
Protocol
1. 배아로 분리 및 인간 줄기 세포 및 사출을위한 준비의 문화
- 이 프로토콜의 예입니다 (뇌, 지방, 골수)로 사용 인간 줄기 세포는 다른 조직에서 여러 가지 방법으로 격리됩니다. 예를 들어, 성인 신경 줄기 세포는 체외에서 교양있는 개별 셀에 다음 dissociated 아르 내시경 신경 외과, 동안 두뇌의 심실 벽에서 수집한 조직 조각에서 격리됩니다. 신경 줄기 세포는 저절로 다른 세포 유형 접시 7 바닥을 준수하면서 문화 매체 부동 neurospheres를 형성하고 있습니다. 지방 - 유래 mesenchymal 줄기 세포는 효소 소화와 섬유 조직을 제거하기 위해 긴장하고 성숙 adipocytes을 제거하는 centrifuged는 지방 흡입 자료에서 얻을 수 있습니다. 그 결과 세포는 다른 세포 유형을 통해 8 조혈 줄기 및 전구 세포가 자기 입자 (Myltenyi Biotec, 독일 복합 특정 항체를 사용하여 긍정적인 선택에 의해 골수 aspirates으로부터 격리 수있는 줄기 세포의 확산을 촉진하기 위해 혈청과 보완 문화 매체 resuspended 아르 또는 Dynal - Invitrogen, 미국)과 자기 세포 분리 및 / 또는 fluorophores 및 형광 활성 세포 분류 (외과) 9 복합 항체를 사용하여.
- 닭 배아에 주입 이전에 형광 표시와 함께 나중에 식별, 라벨 줄기 세포를 촉진합니다. 줄기 세포는 곧 주입하기 전에, 또는 오염 호스트 세포의 기본적없이 위험 영구 라벨, 최대 공급자 권장 프로토콜을 사용하여 이러한 DiI (Invitrogen, 미국) 또는 PKH26 같은 형광 lipophilic 염료 (시그마, 미국)와 함께 표시됩니다 그들은 여전히 문화 10 동안 lentiviral 벡터를 사용하여 그린 형광 단백질과 같은 형광 단백질에 대한 유전자와 transduced 수 있습니다.
- 인간 줄기 세포의 문화와 전파를위한 프로토콜이 다릅니다. 자세한 프로토콜은 문헌에서 찾을 수 있습니다. 자기편 줄기 세포는 일반적으로 배양 접시에 양식 반면 간단히, 영역 - 성형 줄기 세포는 일반적으로 적절한 매체 (분할은 아래를 참고하면 분쇄를 용이하게하는), flasks에서 양식입니다. 분할 또는 수확 들어, 펠릿 영역 - 성형 37도 섭씨에서 더 이상 5 분 이상 미리 예열 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 1200rpm과 resuspend에서 5 분 원심 분리하여 세포를. 자기편 세포 배양 접시에 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가로 5 분 거리의 끝 부분에 씹다하십시오. 때로는 알부민을 구비 매체, + 함유 칼슘 2 추가하여 trypsinization을 종료할 수 있습니다. , 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 제거 세포 (1200rpm에서 5 분) 원심 분리기하려면 (일반적으로 중간 또는 생리 인산염 버퍼) 차가운 주입 차량에 resuspend, 뜨는을 제거하고, (1200rpm에서 5 분) 다시 원심 분리기. 이 뜨는의 대부분을 제거하고 부드럽게 고농도 세포 현탁액을 만드는 세포를 resuspend.
- 최대 몇 시간 이전에 분사하는 얼음에 작은 덮인 유리병 또는 microfuge 관에서 인간 줄기 세포의 정지 보관하십시오. 이 상태에서 생존은 세포 종류에 의존 수 있습니다. 사출 차량들은 adhesivity (예 : 낮은 칼슘 2 + 차량 clumping 방지 도움이 될 수 있습니다) 및 hypoxia와 pH의 변화에 대한 저항을 포함하여 세포의 특성에 따라 최적화되어야합니다.
2. 달걀 부화 및 준비
- ° C 이전의 부화에 14-15에서 : 저장소가 냉각 챔버 (Termaks, 베르겐, 노르웨이, 예를 들어)에 계란을 수정된. 부화가 시작 때까지이 온도 개발에 체포됩니다. 약 10 일 이상이나 낮은 온도에서 저장 수정된 난자는 이후 개발 및 생존의 낮은 비율을했습니다.
- 개발의 원하는 무대가 (준비를 위해 도달할 때까지 심판을 볼 수 38-39시 ° C, 그리고 부화 11 : 개발을 reinitiate하려면, humidified, 강제 통풍 인큐베이터 (바인더, 뉴욕, 미국 예를 들어)에 계란을 넣으십시오. ).
- 계란을 열기 전에 (그림) 난각 (너무 깊이 노른자를 피어싱 피하기 위해)를 통해 18 게이지 주사 바늘을 삽입하고 알부민 4 ML 철수하여 배아 위의 공기 주머니를 만듭니다. 이것은 몇 분 이내에 다공성 껍질을 통해 공기의 항목이 같도록하는 압력 강하를 만듭니다. 공기가 들어가는 것처럼 따라서 껍질의 내부 표면에서 배아를 분리, 셀 내에서 가장 높은 지점에서 수집합니다.
- 기존의 플라스틱 테이프로 주사 바늘에 의해 만들어진 구멍을 밀봉합니다.
3. 유리 micropipettes 당기는
- borosilicate 유리 유리 micropipettes를 당겨 (예를 들어, 1.2mm OD X 0.94 mm ID를, 하버드 장치, 미국) 종래의 전극 풀러에서 (예를 들어, 모델 P - 2000, 셔터 인 스트 루먼트, 미국). microel로 사용하면 높은 입력 저항을 micropipettes를 얻을 풀러 설정을 조정합니다ectrodes. 팁은 약 1-1.5 cm 길이되어야합니다. 통로가 나옵 볼륨을 계산하는 1mm 간격으로 표시되어 있습니다.
- 포셉 그들을 굽힘이나 현미경으로 보는 동안 고체 표면에 대한 그들을 밀고하여 가능한 크기로 micropipette 도움말 브레이크. 휴식은 유리의 주위로서 가능한되어야하며 끝에 표시된 내경은 막힌받지 않고 사용할 수있는 세포의 크기를 수용해야합니다. 일반적으로 20-30 마이크론 내경은 잘 작동합니다.
4. 빠른 그린 염료 솔루션 (대조 시약)의 준비
- (137 MM NaCl, 5 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 1 MM 닭 생리 식염수에 용해하여 빠른 그린 염료 (시그마 - 알드리치, 미국)의 0.1 % (W / V) 솔루션을 준비 나 - 인산염, 5 MM의 HEPES, 11 MM 포도당, 산도 7.4).
- 0.22 μm의 Millex GP 필터 (Millipore (주), 베드 포드, 미국)를 통해 빠른 그린 솔루션을 필터링합니다.
5. 달걀을 열고 배아를 대조
- 공기 주머니의 크기를 덮고, 계란의 상단에있는 테이프의 두 가지를 놓습니다. 계란이 지향 유지할 수있다는 것은 그래서 녹화 면적 (그리고 따라서 공기 주머니)가 자리잡은 것을, 튼튼한 해부 가위를 사용하여 테이프 영역의 경계 내에있는 작은 창문을 했네요. 테이프 지원을 추가하고 배아에 떨어지지 달걀 껍질 조각을 방지하는 데 도움이됩니다. 공기 주머니와 관련된 공기 방울은 플라스틱 피펫 팁 또는 다른 날이 프로브의 백 엔드를 사용하여 쐈고 수 있습니다.
- 25 게이지 바늘로 1 ML의 주사기에 몇몇 빠른 그린 솔루션을 그립니다. 주사기와 바늘에 공기 방울을 제거합니다. 45도 각도로 바늘을 구부, 배아 접시 (그것을 주위에 경계선을 긋다 혈관의 반지로 식별하고, 배아 판 증가 사망률 이내 피어싱) 이외의 지점에 침투하고 조심스럽게 배아에서 뜨개질을지도. 원하는 콘트라스트를 얻을 때까지 염료를 주사. 일반적으로 투명 배아는 이제 어두운 녹색 색상 (그림 B)에 대한 약간 흰 유령으로 눈에 띄는 것입니다. 많은 조사는 인도 잉크 (10 % V / V로 희석) 대신 빠른 그린을 사용합니다. 이 경우에는 Pelikan 파운트 인도 잉크 같은 비 - 독성 인도 잉크를 사용하는 것이 중요합니다.
6. hindbrain 및 척수 신경 튜브 병변 만들기
- 에 의해 날카롭게 텅스텐 바늘을 생산 불꽃 - 에칭 아세틸렌 / 산소 토치로, 100 μm의 직경의 텅스텐 막대 (카탈로그 번호 719000, A & R 시스템, 시애틀, 워싱턴)의 짧은 (2-3 ㎝) 조각. 이것은 날카로운 팁을 남겨두고, 텅스텐의 바깥쪽 레이어의 폭발 침식을 상징하는 불꽃이, 볼 때까지 토치 화염으로 매우 간단히 막대의 끝을 삽입하여 이루어집니다.
- 을 통해 날카롭게 텅스텐 바늘, 슬라이스를 사용하여 미세을위한 지역을 덮고있는 vitelline 멤브레인 비켜.
- 두 번째 날카롭게 텅스텐 바늘 (첫 번째 바늘 끝이 자주 vitelline 막 통해 깔끔히 후 손상 이후 미세에 적합하지 않습니다)를 사용하여 신경 튜브를 overlying 상피를 통해 신중하게 잘라 그것을 비켜 다음, 주위를 잘라 조각 미만 신경 튜브의 짧은 빠른 상향 스트로크 (그림 C)를 사용하여 제거할 수 있습니다. 세로 인하 후 가로 인하가 먼저 만드는 것이 일반적으로 가장 성공적인 것입니다. 심하게하지 마십시오 또는 일반적으로 치명적인 관통 기본 혈관을 위험.
- 부드럽게 플립이나 떨어진 텅스텐 바늘을 사용하여 병변 사이트에서 resected 조직 조각을 끕니다. 이 어려운 증명한다면, 그것은 또한 유연한 튜브에 부착된 유리 micropipette를 사용하여 입 흡입하여 제거할 수 있습니다.
7. 인간 줄기 세포의 주입
A. 신경 튜브의 병변에 주사
플라스틱 튜브를 사용하여 입 흡입하여 유리 micropipette의 일각으로 세포의 작은 금액을 그립니다. 세포 현탁액의 작업 농도는 주입되는 세포 유형에 대한 최적화해야합니다. micromanipulator에 micropipette를 탑재하고 microinjector 펌프 (예 : PV830 공압 PicoPump, WPI, 워싱턴, 미국)에 연결합니다. 해부 현미경을 사용하여 시각적인 통제, 병변에 micropipette 팁 안내 조심스럽게 공기 압력 (중 일정한 압력의 펄스 또는 점차 압력을 끌어 올렸하여) (그림 C)을 증가시켜 세포를 추방. 세포의 원하는 금액이 병변 사이트 내에서 입금하면 신중하게 micropipette를 철회.
B. 신경 튜브의 루멘에 분사
세포 병변의 부재에있는 신경 조직에 대한 액세스 권한을 얻을 정도로 침입하는 경우 어떤 경우에는 그것은 예를 들어, 개발 뇌 심실에 세포를 주입하는 것이 바람직하다 수 있습니다. 모든 BR의 루멘에 세포의 주입당연히 지역 루멘가 큰만큼 소켓을 제공하며 쉽게 접근하는에서 발달 단계를 사용하여 필요, HH 스테이지은 12 18이 점에서 유리한 있습니다. 병변은 필요하지 않습니다. 간단히 피어스 신경 튜브 전에 세포의 주입에 유리 micropipette로의 벽. 이 방법의 성공을 위해 중요한 요소는 micropipette와 침투의 종결의 선명도되며 너무 움직임을 느리게하고 micropipette 팁은 관통하지 않고 신경 튜브 벽 딥플 수 있습니다.
C. 체계적 주사
체계적 주사는 (이러한 혈관이 잘 개발 HH 단계 15 일부터 시작) 엑스트라 배아 혈관을 통해 만들 수 있습니다. 이것은 쓰시 출혈과 함께 많은 작은 동맥과 적은 큰 혈관이 있기 때문에 그것이 배아의 생존에 올 때, 내부 동맥 주사는 일반적으로 안전하지 않습니다. 한편, 정맥 주사 따라서 아마도 세포의 이상도 배포를 심장에 세포의 빠른 액세스를 제공합니다. 성공적인 주입은 대상 선박보다 작은 직경을 가진 날카로운 micropipette이 필요합니다. (약 30도) 수평에서 작은 각도의 축을 따라 선박에 접근한다. 선박은 막다 시작 때까지 선박에 대한 micropipette 밀어. 그런 다음에 침투하는 회사, 갑작스러운 운동에 더 밀어. 혈액 micropipette의 일각으로 모세관 현상에 의해 그려 볼 때까지 천천히 철회. 세포의 주입은 다음 micropipette가 빠른 운동과 철회하는 후, 일정한 압력을 사용하여 수행되어야합니다.
8. 계란을 밀봉
- 주사 후, 계란이 주입된 세포가 정착하고 준수하도록 몇 분 동안 가만히 보자. (빨리 발생할 수 있으며, 치명적인 증명할 수있는) 탈수를 방지하려면 한 조각이 휴식 기간 동안 창을 통해 조직이나 필터 종이 moistened하다.
- 몇 분 세포가 정착되면 창 주변의 껍질을 건조하고 기존의 플라스틱 테이프로 창문을 밀봉. 이 도장이 꽉이며 알부민가 시작이나 껍질 테이프 (이것은 종종 이후 부화하는 동안 치명적인 증명) 사이의 누설 수 없습니다 있는지 확인하십시오.
- 발전을위한 강제 통풍 인큐베이터에 달걀을 바꿉니다. 관찰은 창의를 통해 테이프를 제거하여 간격으로 만들 수 있습니다.
9. 배아 해부
- 일단 배아가 원하는 단계에 도달했습니다, 얼음처럼 차가운 생리 식염수 또는 인산염 버퍼 호수 (창문을 덮고있는 테이프가 별도로 달걀 껍질의 두 반쪽을 허용 최초로 절단한다.)의 그릇에 계란을 깨서 얼음처럼 차가운 호수가 저체온증으로 배아를 마취하는 역할을합니다. 심장이 빠르게 속도와 몇 분 이내에 정지한다.
- extraembryonic 점막에서 배아를 분리하고 심판을 사용하여 그것을 무대. 11.
- 실리콘 고무 층을 가지고 있으며, 포도당 (137 MM NaCl, 5 MM KCl, 2 MM CaCl 2, 1 MM MgCl 2, 1 ㎜ 나 인산, 5 보충 산소 생리 식염수가 들어있는 해부 접시에 전송, 배아 목을 벨 MM의 HEPES, 11 MM 포도당, 산도 7.4)와 빠른 복부 쪽을 핀. 복부와 흉부 내장을 제거합니다. 직각 가위를 사용하여 척추 열의 각 ventrolateral 측면을 따라 세로 incisions합니다. 특히 나중에 단계 (발전 6 일 후)에, 초기 절개는 가장 척추와 척수 사이의 공간이 가장입니다 lumbosacral 지역에서 이루어집니다. 척수를 공개 척추 열의 복부 측면을 제거합니다. 생리 식염 순수 의료 산소와 약 10 분 간격으로 버블링에 의해 산소 남아 있는지 확인합니다.
- 신중하게, 양쪽에 초기 지느러미와 복부 뿌리를 잘라 원하는 수준에서 척수를 가로로 쪼개다, 부드럽게 척추 운하의 그것을 밖으로 리프트. 척수는이 상태에서 몇 시간 동안 생존하고 해부학 12 생리학 13,14 실험의 대상이 될 수 있습니다.
알부민의 피난을위한 그림 1.) 적절한 접근. 배아의 위치와 바늘의 위치를 적어 둡니다. B) 배 (胚)의 대조. 배아 디스크 밖 바늘의 침투 지점을 확인합니다. C) 일방적 척추 신경 관 병변에 대한 프로 시저의 도식 표현은 세포 이식에 의해 따랐다.
Discussion
닭 배아는 xenotransplantation 실험을위한 편리하고 다양한 동물 모델입니다. 배아와 태아 발달 동안 기능 면역 시스템의 부족은 배양 온도를 허용하는 종 세포의 생존과 발전을 수 있습니다. 치킨 배아는 줄기 세포 (심판의 검토. 15) 다양한 종류의 재생 가능성을 테스트하는 데 사용되었습니다. 포유 동물의 줄기 세포들이 그의 axonal 계획 뉴런을 야기할 수있는 중추 신경계를 포함한 닭고기 배아 조직에 통합할 수, 시냅스 연결과 electrophysiological 특성 기능 신경 회로 1,2의 맥락에서 평가하실 수 있습니다.
수술 절차가 비교적 간단하고, 주사 대신 stereotaxic 컨트롤의 시각적하에 만들어진 때문에 배아의 수를 쉽게 하나의 실험 이내에 다른 실험 조건을 수용하기 위해 증가 수 있습니다. 일반적으로 세포는 4 시간 이내에 실험 20-30 배아에 주입 수 있습니다. 배아의 사후 분사 사망률은 주요 제한 요소입니다. 주의 사항은 출혈과 탈수를 피하기 위해 이동해야합니다. 에서 자연 사망률 증가 특정 중요한 발달 단계가있다는 것을 인식한다. 따뜻하고 멸균 치킨 울리는 다음 주입하고 중요한 발달 단계 전날 몇 ML으로 배아를 보완뿐 아니라 계란의 창, 누설을 피하기 위해 잘 밀봉하고 중심이다 생존을 향상 있도록. 테이프 봉인을 통해 누수가 발생된다면, 테이프를 제거 표면 다시 테이프를 건조. 일부 수사관들은 창문을 봉인하기 위해 왁스, 유리 또는 플라스틱 coverslips를 사용합니다. 사망률은 가짜 운항 배아 대 주입에 실질적으로 다를해서는 안됩니다.
우리는 두뇌 및 척수의 anlage에 인간 줄기 세포의 주입에 여기에 초점을 맞추고 있지만, 줄기 세포가 다른 장기의 anlage (예 : 심판에 대한 참조하십시오. 4)로 주입 수 있습니다. 각 기관이 자체적으로 도전 포즈. 예를 들어, 심장에 주사 때문에 섹스를 피펫으로 높은 기계적 저항 때문에 반면에 주입하기 전에 실내 온도에 배아를 냉각에 의해 느려질 수있는 운동의 도전하실 수 있습니다. 루멘 부족 기관은 충분한 볼륨의 주입을 수용하지 않을 수 있습니다 따라서 소켓을 만들 외과 병변이 필요할 수 있습니다. 그것이 조직에 인간 줄기 세포의 통합을 촉진하기 때문에 우리의 경험에서 사후 병변 조직 재생이 장점이다. 전지는 또한 신경 크레스트 - 파생 주변 신경 16,17 포함한 mesenchymal 유도체로 정관를 달성하기위한 방법으로 분산 somitic mesenchyme 또는 마이 그 레이션하는 신경 문장으로 배아 mesenchyme에 주입 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
작품은 Helse OG Rehabilitering (JLB), 노르웨이 연구위원회 (GH 및 JCG)와 오슬로의 대학 (NK과 JCG)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus Corporation |
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