Summary
इस पत्र में हम चिकन भ्रूण के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विभिन्न क्षेत्रों में मानव स्टेम सेल के प्रत्यारोपण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. यह एक प्रदान करता है
Abstract
चिकन भ्रूण सामान्य भ्रूण और भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए और xenotransplantation प्रयोगों के लिए एक शास्त्रीय पशु मॉडल के लिए एक मानकीकृत में कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन है
Protocol
1. अलगाव और भ्रूण में मानव स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति और इंजेक्शन के लिए तैयारी
- मानव स्टेम इस प्रोटोकॉल (मस्तिष्क, वसा, अस्थि मज्जा) में उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया कोशिकाओं विभिन्न ऊतकों से अलग अलग तरीकों से अलग कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं ऊतक इंडोस्कोपिक न्यूरोसर्जरी, जो तब व्यक्तिगत कोशिकाओं है कि इन विट्रो में सुसंस्कृत हैं dissociated के दौरान मस्तिष्क के निलय दीवार से एकत्र टुकड़े से अलग कर रहे हैं . तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं अनायास neurospheres है कि संस्कृति के माध्यम में तैरने लगते हैं जबकि अन्य प्रकार की कोशिकाओं को 7 डिश के नीचे का पालन के रूप में. वसा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम कोशिकाओं है कि enzymatically पचा और तंतुमय ऊतक निकालने के लिए तनावपूर्ण है और फिर परिपक्व adipocytes हटाने centrifuged liposuction सामग्री से प्राप्त कर रहे हैं. परिणामस्वरूप सेल संस्कृति माध्यम में सीरम के साथ पूरक करने के लिए स्टेम कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देने के अन्य प्रकार की कोशिकाओं से अधिक 8 hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं सकारात्मक विशिष्ट चुंबकीय कणों (Myltenyi बायोटेक, जर्मनी संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए चयन के द्वारा अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस से अलग किया जा सकता resuspended या Dynal - Invitrogen, संयुक्त राज्य अमरीका) और चुंबकीय सेल जुदाई, और / या संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग fluorophores और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) 9.
- दाखिल करने से पहले चिकन भ्रूण में एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ बाद में पहचान, लेबल स्टेम कोशिकाओं की सुविधा. स्टेम कोशिकाओं को शीघ्र ही आरोपण से पहले, या, अनिवार्य रूप से कोई खतरा नहीं contaminating मेजबान कोशिकाओं के साथ एक स्थायी लेबल के लिए, DiI (Invitrogen, संयुक्त राज्य अमरीका) या PKH26 जैसे फ्लोरोसेंट lipophilic रंजक (सिग्मा, संयुक्त राज्य अमरीका) आपूर्तिकर्ता की सिफारिश प्रोटोकॉल का उपयोग करने के साथ लेबल किया जा सकता हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तरह एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जीन के साथ वे transduced किया जा सकता है, जबकि अभी भी 10 संस्कृति में lentiviral वैक्टर का उपयोग, .
- संस्कृति और मानव स्टेम कोशिकाओं के प्रसार के लिए प्रोटोकॉल बदलती हैं. विस्तृत प्रोटोकॉल साहित्य में पाया जा सकता है है. संक्षेप में, क्षेत्र बनाने स्टेम कोशिकाओं को आम तौर पर बोतल में सुसंस्कृत हैं, जबकि पक्षपाती स्टेम कोशिकाओं को आमतौर पर पेट्री डिश में संवर्धित कर रहे हैं (जो trituration को सुविधाजनक बनाने के जब बंटवारे, नीचे देखें) उपयुक्त माध्यम है. बंटवारे या कटाई के लिए, गोली क्षेत्र 5 1200rpm और resuspend पर पूर्व गर्म समाधान / trypsin EDTA में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोई अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए मिनट centrifugation द्वारा कोशिकाओं के गठन. पक्षपाती कोशिकाओं पेट्री डिश trypsin / EDTA समाधान जोड़ने के लिए, और 5 मिनट के अंत में triturate लिए. 2 Ca जोड़ने मध्यम, कभी कभी albumin साथ पूरित + युक्त द्वारा trypsinization बर्खास्त. / Trypsin EDTA निकालने के लिए, कोशिकाओं अपकेंद्रित्र (1200rpm पर 5 मिनट), सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, ठंड इंजेक्शन वाहन में resuspend (आम तौर पर मध्यम या खारा फॉस्फेट बफर), और फिर अपकेंद्रित्र (1200rpm पर 5 मिनट). इस सतह पर तैरनेवाला के सबसे निकालें और धीरे कोशिकाओं के लिए एक अत्यधिक ध्यान केंद्रित सेल निलंबन बनाने resuspend.
- मानव स्टेम कोशिकाओं के निलंबन के लिए कई घंटे के लिए पहले इंजेक्शन के लिए एक छोटी सी, छाया microfuge या बर्फ पर ट्यूब शीशी में रखें. इस राज्य में जीवन रक्षा प्रकार पर निर्भर सेल हो सकता है. इंजेक्शन वाहन कोशिकाओं के गुणों के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए उनके adhesivity (उदाहरण के लिए एक कम-ca + 2 वाहन clumping को रोकने में मदद मिल सकती है) और hypoxia और पीएच परिवर्तन के लिए प्रतिरोध सहित.
2. अंडे की ऊष्मायन और तैयारी
- 14-15 ° सी पूर्व ऊष्मायन के लिए: स्टोर एक ठंडा (Termaks, बर्गन, नॉर्वे उदाहरण के लिए) कक्ष में अंडे को निषेचित. इस तापमान के विकास जब तक ऊष्मायन शुरू गिरफ्तार. निषेचित अंडे के बारे में 10 दिनों से अधिक के लिए या कम तापमान पर संग्रहीत बाद विकास और अस्तित्व की एक कम दर है.
- विकास reinitiate करने के लिए, एक humidified, मजबूर मसौदा (उदाहरण के लिए: बांधने की मशीन, न्यू यार्क, संयुक्त राज्य अमेरिका) इनक्यूबेटर में अंडे जगह 38-39 पर ° सी, और सेते हैं जब तक विकास के वांछित मंच (मंचन के लिए पहुँच जाता है, रेफरी देख 11. ).
- अंडे खोलने से पहले, अंडा खोल (भी गहराई से नहीं की जर्दी भेदी से बचने के) के माध्यम से एक 18 गेज सिरिंज सुई डालने और albumin की 4 मिलीलीटर निकालने भ्रूण के ऊपर एक हवा जेब बनाने (एक चित्रा). यह एक दबाव ड्रॉप है कि कई मिनट के भीतर झरझरा खोल के माध्यम से हवा के प्रवेश द्वारा equalized है बनाता है. जैसा कि हवा में प्रवेश करती है यह खोल के भीतर उच्चतम बिंदु पर एकत्र, इस प्रकार के खोल की भीतरी सतह से भ्रूण अलग है.
- पारंपरिक प्लास्टिक टेप के साथ सिरिंज सुई के द्वारा बनाई गई छेद सील.
3. कांच micropipettes खींच
- Borosilicate ग्लास से कांच micropipettes खींचो (उदाहरण के लिए, 1.2mm आयुध डिपो x 0.94 मिमी, आईडी हार्वर्ड उपकरण, संयुक्त राज्य अमरीका) एक पारंपरिक इलेक्ट्रोड खींचने पर (उदाहरण के लिए, पी 2000 मॉडल, Sutter उपकरण, संयुक्त राज्य अमरीका). Micropipettes कि उच्च इनपुट प्रतिरोध है जब microel के रूप में इस्तेमाल किया प्राप्त करने के खींचने सेटिंग्स समायोजितectrodes. युक्तियाँ लगभग 1-1.5 सेमी लंबे समय होना चाहिए. शाफ्ट निकली मात्रा की गणना करने के लिए 1 मिमी के अंतराल में चिह्नित किया जा सकता है.
- उन्हें एक संदंश के साथ झुकने या उन्हें एक ठोस सतह के खिलाफ धक्का जबकि एक खुर्दबीन के नीचे देखने के द्वारा एक व्यावहारिक आकार करने के लिए micropipette सुझावों का तोड़ो. तोड़ के रूप में संभव के रूप में में भी कांच की परिधि के आसपास हो सकता है और परिणामी भीतरी व्यास नोक पर भरा हुआ हो रही बिना इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं के आकार को समायोजित चाहिए. आम तौर पर एक 20-30 माइक्रोन भीतरी व्यास अच्छी तरह से काम करता है.
4. फास्ट ग्रीन डाई समाधान (विषम अभिकर्मक) की तैयारी
- चिकन शारीरिक खारा में भंग (137 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी द्वारा फास्ट ग्रीन डाई (सिग्मा Aldrich, संयुक्त राज्य अमरीका) के एक 0.1% (w / v) समाधान तैयार ना - फॉस्फेट, 5 मिमी HEPES, 11 मिमी ग्लूकोज, 7.4 पीएच).
- 0.22 सुक्ष्ममापी Millex जीपी फिल्टर (Millipore कं, Bedford, संयुक्त राज्य अमरीका) के माध्यम से फास्ट ग्रीन समाधान फ़िल्टर.
5. अंडे खोलना और भ्रूण विषम
- अंडे के शीर्ष पर टेप के दो टुकड़े प्लेस, हवा जेब के आयाम को कवर. अंडे उन्मुख रखते हुए इतना है कि टेप क्षेत्र (और इस प्रकार हवा जेब) सबसे ऊपर है, टेप एक मजबूत विच्छेदन कैंची का उपयोग कर क्षेत्र की सीमाओं के भीतर एक छोटी सी खिड़की में कटौती. टेप समर्थन जोड़ता है और भ्रूण पर गिरने से eggshell टुकड़े को रोकने में मदद करता है है. वायु बुलबुले हवा जेब के साथ जुड़े एक प्लास्टिक विंदुक टिप या अन्य कुंद जांच के पीछे के अंत का उपयोग popped किया जा सकता है.
- एक 25 गेज सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में कुछ फास्ट ग्रीन समाधान ड्रा. सिरिंज और सुई में किसी भी हवाई बुलबुले निकालें. एक 45 डिग्री के कोण करने के लिए सुई बेंड, भ्रूण प्लेट (रक्त वाहिकाओं है कि यह प्रतिबंध लगाना की अंगूठी के द्वारा की पहचान की है, भेदी भ्रूण थाली बढ़ जाती है मृत्यु दर के भीतर) के बाहर एक बिंदु पर घुसना और ध्यान से भ्रूण के तहत लैस गाइड. डाई सुई जब तक वांछित इसके विपरीत हासिल की है. भ्रूण है, जो सामान्य है पारदर्शी अब गहरे हरे रंग (चित्रा बी) के खिलाफ एक सफेद भूत के रूप में बाहर खड़े हो जाना चाहिए. कई जांचकर्ताओं भारत (10% v / v पतला) इंक के बजाय फास्ट ग्रीन का उपयोग करें. इस मामले में यह भारत Pelikan फ़ौवारा भारत इंक जैसे कि गैर विषैले इंक, का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
6. Hindbrain और रीढ़ की हड्डी न्यूरल ट्यूब घावों बनाना
- द्वारा बढ़ाई टंगस्टन सुइयों उत्पादन लौ नक़्क़ाशी 100 सुक्ष्ममापी व्यास टंगस्टन रॉड (सूचीपत्र संख्या 719000, एक और आर सिस्टम्स, सिएटल, वाशिंगटन) से कम (2-3 सेमी) टुकड़े एक मशाल / एसिटिलीन ऑक्सीजन के साथ. यह छड़ी के अंत बहुत संक्षेप में मशाल लौ में जब तक एक चिंगारी देखा है, जो टंगस्टन की बाहरी परत के विस्फोटक कटाव का प्रतिनिधित्व करता है, एक तेज टिप छोड़ने के पीछे डालने के द्वारा किया जाता है.
- के माध्यम से एक तेज टंगस्टन सुई टुकड़ा, का प्रयोग और vitelline microsurgery के लिए क्षेत्र को कवर झिल्ली मोड़ना.
- एक दूसरे तेज टंगस्टन सुई (पहली सुई की नोक vitelline झिल्ली के माध्यम से टुकड़ा करने की क्रिया के बाद अक्सर क्षतिग्रस्त है और बाद microsurgery के लिए फिट नहीं) का उपयोग करना, उपकला के माध्यम से ध्यान में कटौती और न्यूरल ट्यूब overlying मोड़ना, तो चारों ओर कटौती और टुकड़ा के तहत न्यूरल ट्यूब हटाया जा करने के लिए, संक्षेप में, त्वरित उर्ध्व स्ट्रोक (चित्र सी) का उपयोग कर. अनुप्रस्थ कटौती पहली और फिर अनुदैर्ध्य कटौती आम तौर पर सबसे सफल है. बहुत गहरा घाव या नहीं क्या आप मर्मज्ञ अंतर्निहित रक्त वाहिकाओं है, जो आमतौर पर घातक है जोखिम.
- धीरे फ्लिप या resected ऊतक टुकड़ा टंगस्टन सुई का उपयोग करते हुए घाव साइट से दूर खींचें. यदि इस मुश्किल साबित होता है, यह भी मुँह एक गिलास micropipette लचीला टयूबिंग से जुड़ी का उपयोग कर चूषण द्वारा हटाया जा सकता है.
7. मानव स्टेम सेल का इंजेक्शन
ए न्यूरल ट्यूब के घाव में इंजेक्शन
मुँह चूषण द्वारा एक प्लास्टिक की ट्यूब का उपयोग कर एक गिलास micropipette की नोक में कक्षों की एक छोटी राशि ड्रा. सेल निलंबन के काम एकाग्रता सेल इंजेक्ट किया प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. माउंट एक micromanipulator पर micropipette और microinjector पंप है (उदाहरण के लिए: PV830 वायवीय PicoPump, थोक मूल्य सूचकांक, वाशिंगटन, संयुक्त राज्य अमरीका) के लिए इसे कनेक्ट. दृश्य एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग नियंत्रण के तहत, घाव में micropipette टिप गाइड और ध्यान से हवा के दबाव (या तो निरंतर दबाव की दालों या धीरे धीरे ऊपर दबाव को ramping द्वारा) (चित्रा सी) में वृद्धि से कोशिकाओं को निष्कासित. जब कोशिकाओं के वांछित राशि घाव साइट के भीतर जमा है, ध्यान से micropipette वापस ले लें.
ज. न्यूरल ट्यूब के लुमेन में इंजेक्शन
कुछ मामलों में यह उदाहरण के लिए विकासशील मस्तिष्क ventricles में कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए वांछनीय हो सकता है अगर कोशिकाओं को पर्याप्त आक्रामक घावों के अभाव में तंत्रिका ऊतक के लिए पहुँच प्राप्त हो सकता है. कक्षों की किसी भी br के लुमेन में इंजेक्शनऐन क्षेत्र विकास मंच है जिस पर लुमेन एक बड़ा पर्याप्त गोदाम प्रदान करता है और आसानी से पहुँचा का उपयोग की आवश्यकता है, एच.एच. चरणों 12 से 18 इस संबंध में अनुकूल हैं. एक घाव आवश्यक नहीं है. बस पियर्स गिलास कोशिकाओं के इंजेक्शन से पहले micropipette के साथ न्यूरल ट्यूब की दीवार. इस विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण तत्व प्रवेश की micropipette और आकस्मिकता के तीखेपन हैं, भी एक आंदोलन को धीमा और micropipette टिप केवल मर्मज्ञ बिना न्यूरल ट्यूब दीवार हिलकोरे सकता है.
सी. प्रणालीगत इंजेक्शन
प्रणालीगत इंजेक्शन अतिरिक्त भ्रूण रक्त वाहिकाओं (एचएच चरण 15 से शुरू, जब इन जहाजों को अच्छी तरह से विकसित कर रहे हैं) के माध्यम से बनाया जा सकता है है. यह कुछ खून बह रहा द्वारा अपूर्व साथ है और वहाँ के बाद से कई छोटे धमनियों और कम बड़ा नसों हैं, अंतर धमनी इंजेक्शन आम तौर पर कर रहे हैं सुरक्षित जब यह भ्रूण अस्तित्व के लिए आता है. दूसरी ओर, अंतःशिरा इंजेक्शन दिल को कक्षों की जल्दी पहुँच प्रदान करते हैं और इस प्रकार शायद कक्षों की एक और भी अधिक वितरण. एक सफल इंजेक्शन लक्षित पोत की तुलना में छोटे व्यास के साथ एक तेज micropipette की आवश्यकता है. क्षैतिज (लगभग 30 डिग्री) से एक छोटा सा कोण पर अपने अक्ष के साथ जहाज दृष्टिकोण. पोत के खिलाफ micropipette पुश जब तक पोत को रोक देना शुरू होता है. फिर एक फर्म, अचानक आंदोलन के लिए घुसना में आगे धक्का. धीरे धीरे वापस लेना जब तक रक्त micropipette की नोक में केशिका कार्रवाई द्वारा आकर्षित देखा है. कोशिकाओं इंजेक्शन तो लगातार दबाव का उपयोग किया जाना चाहिए, जिसके बाद micropipette एक त्वरित आंदोलन के साथ मुकर है.
8. अंडे सील
- इंजेक्शन के बाद, अंडे कुछ मिनट के लिए अभी भी खड़ा करने के लिए इंजेक्शन कोशिकाओं बसने और का पालन की अनुमति. निर्जलीकरण से बचने के (जो जल्दी होते हैं और घातक साबित कर सकते हैं) करना है, का एक टुकड़ा खिड़की पर इस बाकी अवधि के दौरान ऊतकों या फिल्टर पेपर सिक्त.
- के बाद कुछ मिनट और कोशिकाओं से तय हो चुका है, खिड़की के आसपास खोल सूखी है और पारंपरिक प्लास्टिक टेप के साथ खिड़की मुहर. सुनिश्चित करें कि यह मुहर तंग है और खोलने के माध्यम से या खोल और टेप (इस बाद ऊष्मायन के दौरान अक्सर घातक साबित होता है) के बीच कोई albumin रिसाव कर सकते हैं कि.
- आगे विकास के लिए मजबूर मसौदा इनक्यूबेटर अंडे बदलें. अवलोकन अंतराल पर खिड़की पर टेप को हटाने के द्वारा बनाया जा सकता है.
9. भ्रूण विच्छेदन
- एक बार भ्रूण वांछित चरण में पहुंच गया है, ठंडा शारीरिक खारा या फॉस्फेट-buffered खारा (विंडो को कवर टेप पहली कट जाना चाहिए अलग करने के लिए eggshell के दो हिस्सों की अनुमति). एक कटोरी में अंडे खुला दरार ठंडा खारा हाइपोथर्मिया द्वारा भ्रूण anesthetize कार्य करता है. दिल जल्दी से धीमी गति से और मिनट के एक जोड़े के भीतर बंद कर देना चाहिए.
- Extraembryonic झिल्ली से भ्रूण अलग है और यह मंच रेफरी का उपयोग. 11.
- भ्रूण सिर काटना, यह एक विच्छेदन डिश है कि एक सिलिकॉन रबर मंजिल है और oxygenated शारीरिक ग्लूकोज (137 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी ना - फॉस्फेट, 5 के साथ पूरक खारा होता के लिए स्थानांतरण मिमी HEPES, 11 मिमी ग्लूकोज, पीएच 7.4) और यह तेजी से उदर पक्ष पिन अप. पेट और वक्ष विसरा निकालें. एक angled कैंची का प्रयोग, कशेरुका स्तंभ के प्रत्येक ventrolateral पहलू के साथ अनुदैर्ध्य चीरों बनाते हैं. (विकास के 6 दिन बाद) बाद के चरणों में विशेष रूप से, प्रारंभिक चीरा सबसे अच्छा lumbosacral क्षेत्र है जहां कशेरुकाओं के बीच अंतरिक्ष और रीढ़ की हड्डी की सबसे बड़ी है में किया जाता है. कशेरुका स्तंभ की रीढ़ की हड्डी प्रकट वेंट्रल पहलू निकालें. सुनिश्चित करें कि शारीरिक खारा शुद्ध चिकित्सा ऑक्सीजन के साथ लगभग 10 मिनट के अंतराल पर बुदबुदाती oxygenated रहता.
- ध्यान से दोनों तरफ नवजात पृष्ठीय और उदर जड़ों में कटौती, वांछित स्तर पर रीढ़ की हड्डी आड़ा काट, और धीरे यह कशेरुका नहर से बाहर उठा. रीढ़ की हड्डी के इस राज्य में कई घंटे के लिए जीवित है और 12 संरचनात्मक और शारीरिक प्रयोगों 13,14 के अधीन किया जा सकता है.
चित्रा 1.) Albumin की निकासी के लिए उचित दृष्टिकोण . भ्रूण की स्थिति और सुई के स्थान नोट. बी) भ्रूण के विषम. भ्रूण डिस्क बाहर सुई के प्रवेश बिंदु पर ध्यान दें. सी) प्रक्रिया के एकतरफा रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका ट्यूब घाव के लिए योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व सेल प्रत्यारोपण द्वारा पीछा किया.
Discussion
चिकन भ्रूण xenotransplantation प्रयोगों के लिए एक सुविधाजनक और बहुमुखी पशु मॉडल है. भ्रूण और भ्रूण के विकास के दौरान एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी है और किसी भी प्रजाति है कि ऊष्मायन तापमान बर्दाश्त से कोशिकाओं के अस्तित्व और विकास परमिट. चिकन भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (रेफरी में समीक्षा 15.) के विभिन्न प्रकार के पुनर्योजी क्षमता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. स्तनधारी स्टेम कोशिकाओं को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, जहां वे न्यूरॉन्स जिसका axonal अनुमानों को जन्म दे सकते हैं सहित चिकन भ्रूण के ऊतकों में एकीकृत कर सकते हैं, synaptic कनेक्टिविटी और electrophysiological गुण कार्यात्मक तंत्रिका सर्किट 1,2 के संदर्भ में मूल्यांकन किया जा सकता है.
क्योंकि शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं अपेक्षाकृत आसान है, और इंजेक्शन दृश्य अधीन किए गए हैं stereotaxic नियंत्रण के बजाय, भ्रूण की संख्या आसानी से एक ही प्रयोग के भीतर विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों को समायोजित वृद्धि हुई किया जा सकता है. आमतौर पर कोशिकाओं को एक 4 घंटे प्रयोग के भीतर 20-30 भ्रूण में इंजेक्ट किया जा सकता है है. भ्रूण की मृत्यु के बाद इंजेक्शन के प्रमुख सीमित कारक है. ख़ून का बहाव और निर्जलीकरण से बचने के सावधानियों लिया जाना चाहिए. पता है कि वहाँ पर जो कुछ प्राकृतिक मृत्यु दर बढ़ जाती है महत्वपूर्ण विकास के चरणों रहे हैं. गर्म, निष्फल चिकन घंटी निम्नलिखित इंजेक्शन और महत्वपूर्ण विकास के चरणों से पहले दिन के कुछ एमएल के साथ भ्रूण सप्लीमेंट, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सुनिश्चित करना है कि अंडे में खिड़की के रिसाव से बचने अच्छी तरह से सील और उन्मुख है, अस्तित्व में सुधार. यदि टेप सील के माध्यम से रिसाव हो जाना चाहिए, टेप को निकालने के लिए, सूखी सतहों और फिर टेप. कुछ जांचकर्ताओं मोम और कांच या प्लास्टिक coverslips का उपयोग करने के लिए खिड़की मुहर. मृत्यु दर काफी दिखावा संचालित भ्रूण बनाम इंजेक्शन में अलग नहीं होना चाहिए.
हालांकि हम यहाँ मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के anlage में मानव स्टेम सेल का इंजेक्शन पर ध्यान केंद्रित किया है, स्टेम कोशिकाओं को भी अन्य अंगों की anlage (उदाहरण रेफरी को देखने के लिए 4.) में इंजेक्शन जा सकता है. प्रत्येक अंग की अपनी चुनौतियों poses. उदाहरण के लिए, दिल में इंजेक्शन उच्च यांत्रिक प्रतिरोध करने के लिए पैठ विंदुक के कारण और क्योंकि आंदोलनों, जो दूसरे हाथ पर इंजेक्शन के लिए पहले कमरे के तापमान के लिए भ्रूण ठंडा करके धीमा किया जा सकता है चुनौतीपूर्ण हो सकता है है. अंग है कि एक लुमेन कमी पर्याप्त मात्रा के इंजेक्शन को समायोजित नहीं है और इसलिए शल्य चिकित्सा घाव के लिए एक गोदाम बनाने की आवश्यकता हो सकती है हो सकता है. हमारे अनुभव में, के बाद घाव ऊतक पुनर्जनन एक फायदा है क्योंकि यह ऊतक में मानव स्टेम कोशिकाओं के एकीकरण को बढ़ावा देता है. कक्ष भी dispersing somitic mesenchyme या तंत्रिका शिखा व्युत्पन्न परिधीय ganglia 16,17 सहित mesenchymal डेरिवेटिव, में शामिल प्राप्त करने के तरीके के रूप में पलायन तंत्रिका शिखा जैसे भ्रूण mesenchyme में इंजेक्शन जा सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
काम Helse ओग (JLB) Rehabilitering, नार्वे अनुसंधान परिषद (GH और JCG) और ओस्लो विश्वविद्यालय (एन.के. और JCG) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | Program | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Mice | Jackson Laboratory | ||
| Mathematica | Program | Wolfram | ||
| Image J | Program | National Institutes of Health | ||
| Slidebook | Program | Olympus Corporation |
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