Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية

Published: October 4, 2010 doi: 10.3791/2072

Summary

هذه الورقة تهدف إلى إرشاد القارئ في عملية متكاملة لقوة ذرية المجهر البصرية التصوير الميكانيكي لتحفيز الخلايا الحية في الثقافة. ويرد بروتوكول خطوة بخطوة. وقدم ممثل مجموعة البيانات التي تظهر استجابة الخلية الحية لتحفيز الميكانيكية.

Abstract

لفهم الآلية التي الخلايا الحية الشعور القوات الميكانيكية ، وكيف تستجيب وتتكيف مع بيئتها ، وهي تكنولوجيا جديدة قادرة على التحقيق في سلوك الخلايا الفرعية الخلوية عالية المستوى مع القرار المكانية والزمانية والمتقدمة. وهكذا ، تم دمج مجهر القوة الذرية (AFM) مع مجموع المجهري التأمل الداخلي (TIRF) مضان والقرص التي تدور بسرعة (FSD) المجهري متحد البؤر. منظومة متكاملة قابلة للتطبيق على نطاق واسع عبر طائفة واسعة من الدراسات الحيوية الجزيئية في الخلايا الحية أي ملتصقة ، مما يسمح التصوير الضوئي المباشر للاستجابات الخلايا لتحفيز الميكانيكية في الوقت الحقيقي. وقد أظهرت إعادة ترتيب كبيرة من شعيرات أكتين والالتصاقات البؤرية بسبب تحفيز الميكانيكية المحلية على سطح الخلية التي يسببها قمية تغييرات في الهيكل الخلوي في جميع أنحاء الجسم الخلية. وهذه التقنيات المبتكرة لتوفير معلومات جديدة فهم يعيشون إعادة هيكلة الخلية واستجابة لديناميات القوة الميكانيكية. بروتوكول بيانات مفصلة وممثل المجموعة التي ترد ردا تظهر الخلية الحية لتحفيز الميكانيكية.

Protocol

1. نظرة عامة على النظام المتكامل مجهر

وقد وصف النظام الذي يستخدم المجهر لهذه الدراسات بالتفصيل 1. باختصار ، هو الجمع بين مقلوب أوليمبوس التاسع - 81 مع مرفق TIRF المجهر (أوليمبوس ، ومركز وادي ، والسلطة الفلسطينية) مع CSU - 22 رئيس المسح يوكوجاوا (يوكوجاوا الكتريك المؤتمر الوطني العراقي ، اليابان). هي التي شنت Bioscope SZ مجهر القوة الذرية (Veeco أدوات المؤتمر الوطني العراقي ، وسانتا باربرا ، كاليفورنيا) على رأس المجهر المقلوب البصرية ، ويتم وضع النظام بأكمله على رأس جدول البحوث الصف الضوئي (نيوبورت ، إرفين ، كاليفورنيا).

وترتبط بشكل صارم التجميع مبائر تتألف من الماسح الغزل القرص ، وعجلة تصفية الخارجية والكاميرا الخاصة به EMCCD (روبر العلمية لPhotometrics ، توكسون ، من الألف إلى الياء) مع قاعدة من الألومنيوم لوحة وضعت على منصة السيليكون اللازمة لتخميد الاهتزازات. الماسح مبائر يربط مع المجهر من خلال شفة مع ذوي الياقات البيضاء تتطاول التي يمكن فصله من خلال المجهر AFM القياسات ، مثل عدم وجود اهتزاز من الماسح الغزل القرص سوف يؤثر على قياسات فؤاد. يستخدم ليزر الأرجون ، الكريبتون (أطياف الفيزياء ، ماونتن فيو ، كاليفورنيا) كمصدر الإثارة لكلا TIRF وطرق التصوير مبائر ، وبدلا من ذلك يمكن أن يقترن في اثنين من الألياف البصرية التي توفر ليزر إلى المرفق TIRF أو مسح الرأس ، على التوالي . جهازي التحكم في النظام : Slidebook برنامج يتحكم في التصوير الضوئي وبرامج Nanoscope تسيطر على فؤاد.

2. خلية ثقافة

ينبغي أن توضع الخلايا الحية معربا عن GFP يبني الموجهة ضد بروتينات معينة في طبق زجاج أسفل خلية ثقافة قبل 24 ساعة من التجربة تحفيز الميكانيكية. في يوم من التجربة محل مستنبت الخلايا الحمراء مع المتوسط ​​خالية من الفينول. هي التي شنت على طبق زراعة الخلايا على المسرح مع فؤاد طوق المغناطيسي.

3. فؤاد تلميح إعداد وتعيين مجهر المتابعة

غيض فؤاد مكيفة مع ميكرون 2 biotinilated سيتم غسل الزجاج حبة خمس مرات مع DPBS ثم حضنت 5 دقائق مع أفيدين (1 ملغ / مل) ، وغسلها مرة أخرى مع خمس مرات DPBS ، ثم حضنت 5 دقائق مع 1 ملغ / مل biotinilated فبرونيكتين. وسيتم غسلها غيض خمس مرات أكثر في نهاية 2 ، التي شنت على الماسح الضوئي فؤاد ، ومن ثم سيتم وضع تنورة السيليكون وقائية حول حاملها. تعيين المجهر لمشاهدة الفيديو لمحاذاة الطرف فؤاد في مركز مجال الرؤية. محاذاة رافعة الضوئية من خلال وضع شعاع الليزر في نهاية جدا من ناتئ ، ثم تغيير الهدف إلى هدف تضخم عالية مناسبة لتصوير خلية واحدة. الربيع الدائم للطرف أن تحدد قبل بدء التجربة. وسوف يقاس هذه المعلمة باستخدام الأسلوب توليف الحرارية المتوفرة في البرنامج Nanoscope. التحول من كاميرا الفيديو إلى الكاميرا EMCCD للسماح للتصوير تنوير. ثم ، واختيار الخلية وجلب رأس فؤاد في اتصال مع تلك الخلية محددة. بعد 20 دقيقة وقت الانتظار ، وهو أمر ضروري للاتصال والتصاق قوي لتشكيل فؤاد عند نقطة اتصال مع سطح الخلية ، فإن الإجراء بدء التحفيز الميكانيكي.

4. الميكانيكية تحفيز الخلية الحية

سوف TIRF التصوير 3-4 يكون الأسلوب المفضل لتصور وقياس الالتصاقات البؤرية ، وسيتم استخدام القرص الغزل مبائر التصوير (5) لتصور الهيكل الخلوي أكتين في جميع أنحاء الجسم الخلية. سوف تستخدم في التصوير فؤاد 6 وضع الاتصال في إطار السوائل.

سيتم الحصول على صورة أو TIRF مبائر من الخلية قبل البدء في إجراءات التحفيز الميكانيكي. وسوف يكون ذلك حافزا لتحفيز الميكانيكية عن طريق المسبار AFM functionalized التي سيتم نقل التصاعدي في خطوات منفصلة كل دقيقة 3-5 على مدى فترة من الزمن (1-1،5 ساعات). سيتم تسجيل الخلية رد الفعل والاستجابة بشكل مستمر في البرمجيات Nanoscope على شكل سلسلة من الصور الارتفاع ، كل سطر في الصورة التي تمثل وحدة زمنية من 1 ثانية. في حين أن الحصول على البيانات فؤاد ، المشغل مراقبين في جميع الأوقات ض موقف الطرف فؤاد لتحديد التوقيت المناسب للسحب المقبل.

بعد كل التحفيز الميكانيكي فمن الممكن الحصول على صورة أو TIRF مبائر للخلية في مجال البرمجيات Slidebook ، في حين أن الحصول على البيانات بشكل مستمر فؤاد. ويمكن معالجة الصور البصرية خارج الخط لخلق الأفلام التي تظهر الهيكل الخلوي أكتين التنسيق والتنظيم الالتصاقات. أيضا ، يمكن معالجة كل صورة كميا لتحديد منطقة الخلية ، ومنطقة محددة من البروتين ، وتحليل مورفولوجيا الخلايا العامة.

وفي نهاية التجربة تم سحب غيض من فؤاد فؤاد الخلية ويمكن قياس حساسية طرف في البرنامج Nanoscope.

تجربة حساسة جدا الضجيج! أي الحديث أو لمس خلال المجهر السابقينوينبغي تجنب periment. للحد من الضوضاء في قياسات AFM ، ينبغي مبائر الغزل قرص دي من جانب المجهر. ربما يكون الوقت في انتظار تشكيل التصاق قوي الاتصال بين سطح الخلية وغيض فؤاد تختلف تبعا لنوع من الخلايا المستخدمة والمغلفة مصفوفة على الحافة.

5. ممثل النتائج

الشكل 1
الشكل 1. تم تصوير الأوعية الدموية نفس الخلية العضلات الملساء (VSMC) transfected مع أكتين - mRFP وvinculin GFP من خلال : (أ) AFM على سطح الخلية القمي ، (B) TIRF على سطح الخلايا القاعدية ، و (C) الغزل القرص المجهري مبائر في جميع أنحاء الجسم الخلية. تظهر الصورة كما مبائر إسقاط الحد الأقصى لكومة 3 - D. وترد التداخل الجيدة بين فؤاد وTIRF الغزل أو القرص مبائر الصور في (D) و (ه) على التوالي. حجم الصورة هو 64 × 50 ميكرون.

الشكل 2
الشكل 2. وقد حفزت ميكانيكيا VSMC transfected مع أكتين - mRFP من فؤاد والتقط بواسطة الغزل القرص المجهري مبائر تشير الأسهم إلى ألياف الأكتين ما يلي : (أ) تتبلمر / رشاقته ، (ب) يزيل البلمرة / تختفي ، أو (ج) بسبب ربطة معا إعادة هيكلة أكتين. بيضاء تمثل الخطوط المتقطعة غيض فؤاد فوق الخلية. حجم الصورة 91 × 91 ميكرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التصاقات الهيكل الخلوي 70-10 11-16 والتنسيق والهياكل الديناميكية التي تجميع وتفريق وتسليم وترحيل الخلايا أو الاستجابة لقوة ميكانيكية 17. لديهم وظائف كبيرة في تنظيم نمو الخلايا ، وبقاء ، والتعبير الجيني. معرفة التوزيع الخاصة بها وديناميكية توفر فهما أفضل لكيفية التواصل مع خلايا المصفوفة وبين أنفسهم.

هذا النظام الجديد قابل للتطبيق المجهر على نطاق واسع عبر طائفة واسعة من الدراسات الحيوية الجزيئية في الخلايا الحية أي ملتصقة. المجهر متكاملة تمكن من رصد التغيرات الكمية الفرعية الخلوية السريعة ، ويوفر أداة جديدة مهمة لفهم العملية الأساسية لإعادة عرض الخلوية ردا على القوة الميكانيكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وكان Vinculin - GFP البلازميد هدية من يامادا كينيث والمعاهد الوطنية للصحة ، المعهد الوطني للأبحاث الأسنان والجمجمة ، بيثيسدا بولاية ميريلاند ، وأكتين mRFP - البلازميد كان هدية من مايكل ديفيدسون ، جامعة ولاية فلوريدا ، تالاهاسي (فلوريدا).

وأيد هذا العمل من قبل الجائزة شهادة NSF # 0747334 وAHA الجنسيات SDG # 0835205N لأندريا Trache.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM tip Novascan Technologies, Inc. 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface
avidin Sigma-Aldrich A9275 1mg/mL in DPBS
Fibronectin Sigma-Aldrich F4759 1 mg/mL
DPBS Invitrogen 21600-051
Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells Lonza Inc. VPI-1004
Mattek glass bottom dishes MatTek Corp. P60G-1.5-30-F Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
  2. Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).
  3. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
  4. Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).
  5. Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
  6. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
  7. Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
  8. Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
  9. Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
  10. Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
  11. Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
  12. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
  13. Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
  14. Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
  15. Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
  16. Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).

Tags

البيولوجيا الخلوية ، العدد 44 ، الخلايا الحية ، والتحفيز الميكانيكي ، الفحص المجهري متكاملة ، ذرية المجهر قوة ، والغزل القرص مبائر ، التأمل الداخلي الإجمالي مضان
يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Trache, A., Lim, S. Live CellMore

Trache, A., Lim, S. Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (44), e2072, doi:10.3791/2072 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter