Summary
इस कागज संस्कृति में जीवित कोशिकाओं के यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक एकीकृत परमाणु के आपरेशन में पाठक बल ऑप्टिकल इमेजिंग खुर्दबीन हिदायत करना है. एक कदम-by-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. एक प्रतिनिधि डेटा सेट है कि रहते सेल यांत्रिक उत्तेजना के जवाब से पता चलता है प्रस्तुत किया है.
Abstract
व्यवस्था है जिसके द्वारा जीवित कोशिकाओं यांत्रिक बलों भावना को समझते हैं, और वे जवाब कैसे और अपने पर्यावरण के लिए अनुकूल, एक नई उप सेलुलर स्तर पर उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ कोशिकाओं के व्यवहार की जांच करने में सक्षम प्रौद्योगिकी विकसित किया गया था. इस प्रकार, एक परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी (AFM) कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी और तेजी से कताई डिस्क (FSD) confocal माइक्रोस्कोपी के साथ एकीकृत किया गया था. एकीकृत प्रणाली मोटे तौर पर किसी भी पक्षपाती जीवित कोशिकाओं में आणविक गतिशील अध्ययन के एक व्यापक रेंज भर में लागू है, वास्तविक समय में यांत्रिक उत्तेजना को सेल प्रतिक्रियाओं का प्रत्यक्ष ऑप्टिकल इमेजिंग की अनुमति. Actin filaments और फोकल adhesions की अहम पुनर्व्यवस्था शिखर कोशिका की सतह पर स्थानीय यांत्रिक उत्तेजना है कि सेल शरीर भर में सेलुलर संरचना में परिवर्तन प्रेरित करने के लिए कारण दिखाया गया था. इन नवीन तकनीकों यांत्रिक बल के जवाब में रहते सेल पुनर्गठन और गतिशीलता को समझने के लिए नई जानकारी प्रदान करेगा. एक विस्तृत प्रोटोकॉल और एक प्रतिनिधि डेटा सेट है कि शो के रहते सेल यांत्रिक उत्तेजना के जवाब प्रस्तुत कर रहे हैं.
Protocol
1. एकीकृत माइक्रोस्कोप प्रणाली का अवलोकन
खुर्दबीन प्रणाली है कि इन अध्ययनों के लिए प्रयोग किया जाता है 1 विस्तार में वर्णित किया गया है. संक्षेप में, TIRF लगाव (ओलिंप, केंद्र घाटी, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के साथ एक औंधा ओलिंप खुर्दबीन नौवीं-81 के साथ संयुक्त है CSU-22 Yokogawa स्कैनिंग सिर (Yokogawa इलेक्ट्रिक इंक, जापान). एक BioScope SZ परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी (Veeco उपकरण इंक, सांता बारबरा, CA) ऑप्टिकल उलटा माइक्रोस्कोप के शीर्ष पर रखा है, और पूरी प्रणाली (न्यूपोर्ट, Irvine, CA) एक अनुसंधान ग्रेड ऑप्टिकल तालिका के शीर्ष पर रखा गया है.
confocal स्कैनर कताई डिस्क, बाहरी फिल्टर पहिया और अपने EMCCD कैमरा (वैज्ञानिक Photometrics नट, Tucson, AZ) से बना विधानसभा rigidly एक सिलिकॉन कंपन भिगोना के लिए आवश्यक पैड पर रखा एक एल्यूमीनियम बेस प्लेट के साथ जुड़े हुए हैं. confocal स्कैनर निकला हुआ किनारा के माध्यम से खुर्दबीन के साथ जोड़ता है एक treaded कॉलर कि AFM माप के दौरान माइक्रोस्कोप से decoupled किया जा सकता है के साथ ऐसी है कि कताई डिस्क स्कैनर से कोई कंपन AFM माप को प्रभावित करेगा. एक आर्गन क्रिप्टोन लेजर (स्पेक्ट्रा भौतिकी, माउंटेन व्यू, सीए) दोनों TIRF और confocal इमेजिंग मोड के लिए उत्तेजना स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है, और वैकल्पिक रूप से दो ऑप्टिकल फाइबर जो TIRF लगाव या स्कैनिंग सिर लेजर उद्धार में युग्मित किया जा सकता है क्रमशः, . दो कंप्यूटर प्रणाली नियंत्रण: Slidebook सॉफ्टवेयर ऑप्टिकल इमेजिंग नियंत्रण और Nanoscope सॉफ्टवेयर AFM नियंत्रण.
2. सेल संस्कृति
लाइव कोशिकाओं GFP व्यक्त विशिष्ट प्रोटीन के खिलाफ लक्षित constructs एक गिलास नीचे सेल संस्कृति डिश में रखा जाना चाहिए यांत्रिक उत्तेजना प्रयोग करने के लिए 24 घंटे पहले. प्रयोग के दिन लाल मुक्त phenol के माध्यम के साथ सेल संस्कृति माध्यम की जगह. सेल संस्कृति डिश AFM मंच पर एक चुंबकीय कॉलर के साथ मुहिम शुरू की है.
3. AFM टिप तैयारी और माइक्रोस्कोप सेट अप
AFM टिप एक 2 माइक्रोन के साथ अनुकूलित biotinilated ग्लास मनका DPBS के साथ पांच बार धोया होगा और तब avidin (1 मिलीग्राम / एमएल) के साथ 5 मिनट incubated, DPBS पांच बार के साथ फिर से धोया, और तब 1 मिलीग्राम / एमएल biotinilated के साथ 5 मिनट incubated fibronectin. टिप 2 अंत में पांच गुना अधिक हो धोया जाएगा, AFM स्कैनर पर घुड़सवार, और तब सुरक्षात्मक सिलिकॉन स्कर्ट धारक के आसपास रखा जाएगा. वीडियो देखने के लिए माइक्रोस्कोप सेट AFM टिप देखने के क्षेत्र के केंद्र में संरेखित. ब्रैकट के बहुत अंत में लेजर बीम रखकर ऑप्टिकल लीवर संरेखित करें, और फिर एक उच्च बढ़ाई एकल कक्ष इमेजिंग के लिए उचित उद्देश्य के लिए उद्देश्य बदल. टिप के निरंतर वसंत प्रयोग शुरू करने से पहले निर्धारित किया है. यह पैरामीटर थर्मल धुन Nanoscope सॉफ्टवेयर में उपलब्ध पद्धति का उपयोग करके मापा जाएगा. वीडियो कैमरे से EMCCD कैमरे के लिए स्विच करने के लिए पुष्पन इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं. फिर, किसी कक्ष का चयन और AFM टिप है कि विशेष सेल के साथ संपर्क में लाने. 20 मिनट प्रतीक्षा समय है, जो एक मजबूत फोकल आसंजन AFM कोशिका की सतह के साथ संपर्क के बिंदु पर फार्म के लिए आवश्यक है के बाद, यांत्रिक उत्तेजना प्रक्रिया शुरू कर देंगे.
4. लाइव सेल के यांत्रिक उत्तेजना
TIRF 3-4 इमेजिंग visualizing और बढ़ाता फोकल adhesions के लिए पसंद की विधि हो जाएगा, और कताई डिस्क confocal 5 इमेजिंग सेल शरीर भर में actin cytoskeleton visualizing के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. 6 AFM संपर्क मोड इमेजिंग में तरल पदार्थ के तहत इस्तेमाल किया जाएगा.
सेल के एक TIRF या confocal छवि यांत्रिक उत्तेजना प्रक्रिया शुरू करने से पहले प्राप्त हो जाएगा. यांत्रिक उत्तेजना functionalized AFM जांच कि असतत चरणों में ऊपर की ओर जाएगा हर 3-5 मिनट ले जाया पर समय की अवधि (1-1.5 घंटे) के द्वारा प्रेरित किया जा जाएगा. सेल प्रतिक्रियाशील प्रतिक्रिया ऊंचाई छवियों, 1 सेकंड के एक इकाई के समय का प्रतिनिधित्व छवि में प्रत्येक पंक्ति की एक श्रृंखला के रूप Nanoscope सॉफ्टवेयर में दर्ज की लगातार हो जाएगा. जबकि AFM डेटा प्राप्त ऑपरेटर पर नज़र रखता है हर समय टिप AFM z स्थिति अगले खींचने के लिए उचित समय निर्धारित करने के लिए.
प्रत्येक यांत्रिक उत्तेजना के बाद यह संभव है Slidebook सॉफ्टवेयर में सेल के एक TIRF या confocal छवि अधिग्रहण, जबकि लगातार AFM डेटा प्राप्त. ऑप्टिकल छवियों बंद लाइन संसाधित किया जा सकता है कि actin cytoskeleton और फोकल adhesions पुनर्गठन दिखाने के लिए फिल्में बनाने के लिए. इसके अलावा, प्रत्येक छवि के मात्रात्मक संसाधित किया जा सकता है सेल क्षेत्र, विशिष्ट प्रोटीन क्षेत्र निर्धारित करते हैं, और सामान्य सेल आकारिकी का विश्लेषण.
Nanoscope सॉफ्टवेयर में प्रयोग AFM टिप सेल और AFM टिप संवेदनशीलता से वापस ले लिया है के अंत में मापा जाएगा.
प्रयोग बहुत शोर संवेदनशील है! कोई बात कर या पूर्व के दौरान छू खुर्दबीनperiment बचा जाना चाहिए. AFM माप में शोर को कम करने के लिए, कताई - डिस्क confocal होना चाहिए खुर्दबीन से डे मिलकर. इंतज़ार कर रहे समय कोशिका की सतह और AFM टिप के बीच एक मजबूत फोकल आसंजन के रूप में सेल इस्तेमाल किया प्रकार और टिप पर लेपित मैट्रिक्स के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. समान संवहनी चिकनी मांसपेशी (VSMC) सेल actin mRFP और vinculin - GFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट द्वारा imaged था: (ए) शिखर कोशिका की सतह पर AFM, (बी) TIRF बेसल सेल की सतह पर, और (सी) कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी सेल शरीर भर में. confocal छवि एक 3 - डी ढेर की अधिकतम प्रक्षेपण के रूप में दिखाया है. AFM और TIRF या कताई डिस्क confocal छवियों के बीच अच्छा overlaps (डी) और (ई), क्रमशः में दिखाए जाते हैं . छवि का आकार 64 x 50 माइक्रोन है.
चित्रा 2. एक actin-mRFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट VSMC AFM द्वारा यंत्रवत् प्रेरित किया गया था और कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged तीर actin फाइबर कि संकेत मिलता है: (क) / polymerize और अधिक मोटा होना, (ख) depolymerize / गायब हो जाते हैं, या (ग) एक साथ बंडल कारण. actin के पुनर्गठन के लिए. व्हाइट धराशायी लाइनों सेल ऊपर AFM टिप का प्रतिनिधित्व करते हैं. छवि का आकार 91 x 91 माइक्रोन.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytoskeleton 7-10 और फोकल adhesions 11-16 गतिशील संरचनाओं कि इकट्ठा, फैलाने और पर बारी के रूप में कक्षों की ओर पलायन या यांत्रिक बल के करने के लिए 17 जवाब हैं. वे सेल के विकास, अस्तित्व, और जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में महत्वपूर्ण कार्य किया है. उनकी विशिष्ट वितरण और गतिशीलता को जानने कैसे कोशिकाओं मैट्रिक्स के साथ और खुद के बीच संवाद की एक बेहतर समझ प्रदान करता है.
यह नया माइक्रोस्कोप प्रणाली मोटे तौर पर किसी भी पक्षपाती जीवित कोशिकाओं में आणविक गतिशील अध्ययन के एक व्यापक रेंज भर में लागू है. एकीकृत माइक्रोस्कोप तेजी उप सेलुलर परिवर्तन के मात्रात्मक निगरानी के लिए सक्षम बनाता है और यांत्रिक बल के जवाब में सेलुलर remodeling के मौलिक प्रक्रिया को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपन्यास उपकरण प्रदान करता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
प्लाज्मिड Vinculin - GFP केनेथ यामादा, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, दंत चिकित्सा और craniofacial रिसर्च राष्ट्रीय संस्थान, बेथेस्डा, मेरीलैंड, और actin-mRFP प्लाज्मिड से एक उपहार था माइकल डेविडसन, फ्लोरिडा स्टेट यूनिवर्सिटी, Tallahassee, फ्लोरिडा से एक उपहार था.
यह काम NSF कैरियर पुरस्कार 0747334 # और अहा राष्ट्रीय # 0835205N SDG Andreea Trache द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
