Summary
本文旨在指导读者在原子操作的综合力量光学成像显微镜文化的活细胞的机械性刺激。一个一步一步的协议。一个有代表性的数据集显示活细胞的机械性刺激的反应。
Abstract
要理解这一机制的活细胞检测的机械力，以及他们如何应对和适应他们的环境，新的技术能够在亚细胞水平研究细胞的行为，具有高时空分辨率的开发。集成与全内反射荧光（TIRF）显微镜和快速旋转的磁盘（FSD）的共聚焦显微镜，原子力显微镜（AFM）。大致横跨在任何附着的活细胞的分子动力学研究的一个广泛适用的集成系统，可以直接实时的机械刺激细胞反应的光学成像。微丝和粘着斑的重大重排的结果表明，由于地方根尖细胞表面的机械刺激，诱导到整个细胞体细胞结构的变化。这些创新技术将提供新的信息，了解机械力活细胞的结构调整和动态。一个详细的协议和有代表性的数据显示活细胞机械性刺激的反应是。
Protocol
1。集成的显微镜系统概述
这些研究中使用的显微镜系统，已被描述详细1。简单地说，一个倒置的奥林巴斯IX - 81 TIRF附件显微镜（奥林巴斯，中心谷，PA）结合CSU - 22横河扫描头（横河电机公司，日本）。一个放映机深圳原子力显微镜（威科仪器公司，圣巴巴拉，CA）是安装在光学倒置显微镜上，和整个系统的研究级光学表上方（新港，IRVINE，CA）。
从旋转的磁盘扫描仪，外部滤镜轮和EMCCD相机（罗珀科学Photometrics，图森，亚利桑那州）组成的共聚焦大会是硬性连接铝基板放在硅垫减振必要。共焦扫描仪与显微镜通过法兰与treaded领，可以在原子力显微镜测量显微镜脱钩，没有旋转的磁盘扫描程序的振动会影响的原子力显微镜测量。氩氪激光（光谱物理，加州山景城）是用来作为激发源为TIRF和共聚焦成像模式，并可以加上另外两个光纤提供的激光TIRF附件或扫描头，分别。两台计算机控制系统：Slidebook软件控制的光学成像和奈米级软件控制的原子力显微镜。
2。细胞培养
活细胞表达GFP对针对特定的蛋白质的构造应被放置在玻璃底部的细胞培养皿中的机械性刺激实验前24小时。在实验之日起，代替无酚红培养基的细胞培养液中。细胞培养皿中的原子力显微镜的舞台上安装带有磁性的衣领。
3。针尖的制备和显微镜设置
2微米定制针尖biotinilated玻璃珠将与DPBS冲洗5次，然后与抗生物素蛋白（1毫克/毫升）孵育5分钟，再洗净，用DPBS五倍，然后孵育5分钟1毫克/毫升biotinilated纤维连接蛋白。提示将在2月末洗5次以上，装上的原子力显微镜扫描仪，然后将保护硅裙各地的持有人。设置观看视频显微镜针尖在视野的中心对齐。通过放置在悬臂的激光束对准光杆，然后改变目标，高放大倍率的目标，适当的单细胞成像。针尖弹簧常数在实验开始前确定。此参数将采用热调整的方法，在奈米级软件。从摄像头开关EMCCD相机，让花期成像。然后，选择一个单元格，使针尖在接触特定细胞。经过20分钟的等待时间，这是一个强烈的粘着，在原子力显微镜与细胞表面的接触点形成所必需的，机械性刺激过程将开始。
4。活细胞的机械性刺激
TIRF成像3-4将可视化和量化粘着斑的首选方法，将用于可视化整个细胞体内的肌动蛋白细胞骨架和旋转盘共聚焦成像。原子力显微镜6将用于下流体的接触模式成像。
一个细胞TIRF或共聚焦图像将被收购开始前的机械性刺激过程。机械性刺激会诱发功能化的原子力显微镜的探针在离散的步骤，将向上移动过一段时间（1-1.5小时），每3-5分钟。细胞的活性反应将被记录不断一系列高度图像，每一行代表了1秒单位时间内的形象在奈米级软件。虽然收购的AFM数据，操作员显示器针尖Z -位置，在任何时候都确定为往后拉的适当时机。
每个机械性刺激后很可能获得一个细胞Slidebook软件TIRF或共聚焦图像，同时，不断收购的AFM数据。光学图像处理脱线，显示肌动蛋白细胞骨架和粘着斑重组创造电影。此外，每个可以处理图像，定量，以确定细胞的区域，特定的蛋白质面积，并分析一般的细胞形态。
在针尖是从细胞和针尖的灵敏度撤回实验年底将在奈米级软件的测量。
实验是非常敏感的噪音！在接触前的任何谈话或显微镜应避免periment。为了尽量减少在原子力显微镜测量的噪音，旋转磁盘焦应取消加上从显微镜。取决于使用的细胞类型和矩阵涂在刀尖上，形成强有力的细胞表面和针尖之间的粘着的等待时间可能会有所不同。
5。代表性的成果
图1。相同的血管平滑肌细胞（VSMC）肌动蛋白- MRFP和纽- GFP转成像是：（一）在根尖细胞表面的原子力显微镜（B）TIRF在基底细胞表面;及（C）纺纱盘共聚焦显微镜作为一个3 - D堆叠的最大投影，整个细胞的身体。共聚焦图像显示。良好的AFM和TIRF或旋转盘共聚焦图像之间的重叠显示在（D）和（E）分别。图像尺寸为64 × 50微米。
图2。机械刺激血管平滑肌细胞与肌动蛋白- MRFP转一个由原子力显微镜和旋转盘共聚焦显微镜成像的箭头指示肌动蛋白纤维：（一）聚合/勾芡，（二）解聚/消失，或（c）捆绑在一起肌动蛋白重组。白色虚线表示的单元格上方的针尖。图像尺寸91 × 91微米。
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Discussion
细胞骨架的 7-10和粘着斑 11-16是动态的结构组合，分散和细胞迁移或回应机械力 17 。他们有重要的功能，调节细胞生长，生存，和基因表达。知道他们的具体分配和动态，提供了一个更好地了解细胞如何与基体和它们之间的沟通。
这种新的显微镜系统是大致跨越任何附着的活细胞的分子动力学研究的广泛适用。集成的显微镜，使亚细胞快速变化的定量监测，并提供了一个了解的细胞重塑的根本过程中，在机械力的重要的新工具。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
纽- GFP质粒午山田，美国国立卫生研究院，国立牙科和颅面研究所，马里兰州贝塞斯达，和肌动蛋白- MRFP的质粒的礼物，是一个礼物，佛罗里达州立大学，佛罗里达州塔拉哈西，从迈克尔戴维森。
这项工作是支持由美国国家科学基金会职业奖＃0747334和AHA国家SDG＃0835205N Andreea气管。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
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