Summary
Detta dokument syftar till att instruera läsaren i driften av ett integrerat atomic force-optisk avbildning mikroskop för mekanisk stimulering av levande celler i kultur. En steg-för-steg-protokollet presenteras. En representant datauppsättning som visar levande cell svar på mekanisk stimulering presenteras.
Abstract
För att förstå den mekanism genom vilken levande celler känsla mekaniska krafter och hur de reagerar och anpassa sig till sin miljö, en ny teknik kan undersöka cellerna beteende vid sub-cellnivå med hög tidsmässiga och geografiska utvecklades. Således var ett atomkraftsmikroskop (AFM) integrerad med en total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi och snabbt snurrande skiva (FSD) konfokalmikroskopi. Det integrerade systemet som är brett tillämpbar inom ett brett spektrum av molekylära dynamiska studier i någon anhängare levande celler, vilket gör att direkt optisk avbildning av cell svar på mekanisk stimulering i realtid. Betydande ombildning av aktin filament och fokus sammanväxningar visades på grund av lokal mekanisk stimulering på apikala cellytan som inducerade förändringar i cellstrukturen i hela cellkroppen. Dessa innovativa tekniker kommer att ge ny information för att förstå levande cell omstrukturering och dynamik som svar på mekanisk kraft. En detaljerad protokoll och en representant datauppsättning som visar levande cell svar på mekanisk stimulering presenteras.
Protocol
1. Översikt över det integrerade Mikroskop System
Mikroskopet system som används för dessa studier har beskrivits i detalj 1. Kortfattat är en inverterad Olympus IX-81 mikroskop med TIRF bilaga (Olympus, Center Valley, PA) i kombination med CSU-22 Yokogawa skanning huvudet (Yokogawa Electric Inc, Japan). En Bioscope SZ atomkraftsmikroskop (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, Kalifornien) är monterad på toppen av den optiska inverterat mikroskop, och hela systemet är placerad på toppen av ett forsknings-klass optisk tabellen (Newport, Irvine, CA).
Den konfokala församling består av spinning-disk scanner, externt filter hjulet och dess EMCCD kamera (Roper Scientific-ljustekniska, Tucson, AZ) är fast förbundna med en aluminium fotplatta placeras på en kisel platta som behövs för vibrationsdämpning. Den konfokala scannern ansluts med mikroskop genom en fläns med en regummerade krage som kan frikopplas från mikroskopet under AFM mätningar, så att ingen vibrationer från spinning-disk scanner kommer att påverka AFM mätningar. En argon-krypton laser (Spectra Physics, Mountain View, CA) används som exciteringskälla för både TIRF och konfokala lägen imaging och kan kopplas alternativt två optiska fibrer som ger lasern till TIRF kvarstad eller skanna huvudet, respektive . Två datorer styra systemet: Slidebook programvara styr optisk avbildning och NanoScope programvara styr AFM.
2. Cell Culture
Levande celler som uttrycker GFP konstruerar riktade mot specifika proteiner ska placeras i ett glas botten cellkultur maträtt 24 timmar före den mekaniska stimulering experimentet. På dagen för experimentet ersätta cellkulturens medium med fenolrött utan medium. I cellkultur maträtt är monterad på AFM scenen med en magnetisk krage.
3. AFM Tips Beredning och Mikroskop Set-up
AFM spets anpassas med en 2 micron biotinilated glaspärlor kommer att tvättas fem gånger med DPBS och sedan inkuberas 5 min med avidin (1 mg / ml), tvättas igen med DPBS fem gånger, och sedan inkuberas 5 min med 1 mg / ml biotinilated fibronektin. Tipset kommer att spolas fem gånger i slutet 2, monterad på AFM skannern och sedan den skyddande silikon kjol kommer att placeras runt hållaren. Ställ mikroskop för filmvisning att anpassa AFM spets i centrum av synfältet. Rikta den optiska spaken genom att placera laserstråle i slutet av fribärande och ändra målet att en hög förstoring mål korrekt för enstaka cell imaging. Våren konstant spetsen måste bestämmas innan experimentet. Denna parameter kommer att mätas med hjälp av den termiska melodi metoden tillgänglig i NanoScope programvaran. Växla från videokamera till EMCCD kamera för att möjliggöra BLOMNINGSTID avbildning. Välj sedan en cell och få AFM spets i kontakt med den specifika cellen. Efter 20 min väntetid, vilket är nödvändigt för en stark fokus vidhäftning form på AFM kontaktpunkt med cellytan, kommer den mekaniska stimulering förfarande start.
4. Mekanisk stimulering av levande celler
TIRF avbildning 3-4 kommer att vara den viktigaste metoden för att visualisera och kvantifiera fokus adherenser, och spinning-disk konfokala imaging 5 kommer att användas för att visualisera aktin cytoskelettet i hela cellkroppen. AFM 6 kommer att användas i kontakt med mode scanning i vätska.
En TIRF eller konfokala bild av cellen kommer att förvärvas innan den mekaniska stimulering förfarande. Den mekaniska stimulansen kommer att framkallas av functionalized AFM sond som kommer att flyttas uppåt i diskreta steg var 3-5 minuter under en viss tid (1-1,5 timmar). Cellen reaktiva-svar kommer att registreras kontinuerligt i NanoScope mjukvara som en serie höjd bilder, varje rad i bilden motsvarar en tidsenhet på 1 sek. Medan förvärva AFM data, övervakar operatören hela tiden z-positionen för AFM spets för att bestämma den rätta tidpunkten för nästa drag.
Efter varje mekanisk stimulering är det möjligt att förvärva en TIRF eller konfokala bild av cell i Slidebook programvara, medan kontinuerligt skaffa AFM data. Den optiska bilder kan bearbetas off-line för att skapa filmer som visar aktin cytoskelettet och fokala sammanväxningar omorganisation. Dessutom kan varje bild behandlas kvantitativt bestämma cellens yta, specifikt protein område, och analysera den allmänna cellmorfologin.
I slutet av försöket AFM spets dras tillbaka från cellen och AFM spets känslighet kommer att mätas i NanoScope programvaran.
Experimentet är mycket ljudkänsliga! Alla pratar eller mikroskop röra vid frittexperimentera bör undvikas. För att minimera bullret i AFM mätningarna bör spinning-disk konfokala frikopplas från mikroskopet. Väntetiden för att bilda ett starkt fokus vidhäftning mellan cellytan och AFM spets kan variera beroende på vilken celltyp och matrisen beläggning på spetsen.
5. Representativa resultat
Figur 1. Samma glatta muskelceller (VSMC) transfererats med aktin-mRFP och vinculin-GFP avbildades av: (A) AFM på apikala cellytan, (B) TIRF på basala cellytan, och (c) spinning-disk konfokalmikroskopi i hela cellen kroppen. konfokala bilden visas som maximal projektion av ett 3-D stack. Bra överlappningar mellan AFM och TIRF eller spinning-disk konfokala bilder visas i (D) och (E), respektive. Bildstorleken är 64 x 50 micron.
Figur 2. En VSMC transfererats med aktin-mRFP var mekaniskt stimuleras av AFM och avbildade med spinning-disk konfokalmikroskopi Pilarna anger aktin fibrer som:. (A) polymerisera / tjocknar, (b) depolymerize / försvinner, eller (c) fästa ihop på grund till aktin omstrukturering. Vit streckade linjerna representerar AFM spets ovanför cellen. Bildstorlek 91 x 91 micron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytoskelettet 7-10 och fokus sammanväxningar är 11-16 dynamiska strukturer som monterar, sprida och vänd över som celler migrera eller svarar på mekanisk kraft 17. De har betydande funktioner i regleringen av celltillväxt, överlevnad och genuttryck. Att veta deras specifika distribution och dynamik ger en bättre förståelse för hur celler kommunicerar med matris och mellan sig.
Det nya mikroskop systemet är mångsidigt användbar inom ett brett spektrum av molekylära dynamiska studier i någon anhängare levande celler. Den integrerade Mikroskopet möjliggör kvantitativ övervakning av snabba sub-cellulära förändringar och utgör ett viktigt nytt verktyg för att förstå den grundläggande processen av cellulära ombyggnad till följd av mekanisk kraft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vinculin-GFP plasmid var en gåva från Kenneth Yamada, National Institutes of Health, National Institute of Dental och Craniofacial Forskning, Bethesda, Maryland, och aktin-mRFP plasmid var en gåva från Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, Florida.
Detta arbete stöddes av NSF Karriär utmärkelse # 0747334 och AHA-National SDG # 0835205N till Andreea Trache.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
