Summary
Dieses Papier soll den Leser in den Betrieb eines integrierten atomic force-optische Bildgebung Mikroskop für die mechanische Stimulation von lebenden Zellen in Kultur zu unterrichten. Eine Schritt-für-Schritt-Protokoll vorgestellt. Eine repräsentative Datenmenge, die Live-Zell-Antwort auf mechanische Stimulation zeigt vorgestellt.
Abstract
Um zu verstehen, den Mechanismus, mit dem sich lebende Zellen Sinn mechanische Kräfte, und wie sie zu reagieren und an ihre Umgebung anpassen, eine neue Technologie in der Lage, Zellen Verhalten bei sub-zellulärer Ebene zu untersuchen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung entwickelt wurde. So wurde ein Rasterkraftmikroskop (AFM) mit Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie und schnell drehenden Scheibe (FSD) konfokale Mikroskopie integriert. Das integrierte System ist breit anwendbar für eine Vielzahl von molekularen dynamischen Studien in anhaftendem lebenden Zellen, die eine direkte optische Bildgebung von Zell-Reaktionen auf mechanische Reize in Echtzeit. Signifikante Umlagerung des Aktin-Filamente und fokalen Adhäsionen war aufgrund der örtlichen mechanische Stimulation an der apikalen Zelloberfläche, dass Veränderungen in der Zellstruktur im gesamten Zellkörper induzierte gezeigt. Diese innovative Technik wird neue Informationen zum Verständnis lebender Zellen Umstrukturierung und Dynamik in Reaktion auf die mechanische Kraft. Ein detailliertes Protokoll sowie ein Vertreter Datensatz, zeigen Live-Zell-Antwort auf mechanische Reize präsentiert werden.
Protocol
1. Übersicht über die Integrierte Mikroskop-System
Das Mikroskop-System, das für diese Studien verwendet wird, hat in detail 1 beschrieben worden. Kurz gesagt, ist eine umgekehrte Olympus IX-81-Mikroskop mit TIRF Befestigung (Olympus, Center Valley, PA) in Kombination mit CSU-22 Yokogawa Abtastkopf (Yokogawa Electric Inc, Japan). Ein Bioscope SZ Rasterkraftmikroskop (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) ist auf der Oberseite des optischen inverse Mikroskop montiert, und das gesamte System ist auf der Spitze eines Forschungs-grade optischen Tisch (Newport, Irvine, CA) platziert.
Das konfokale Montage von der Spinnerei-Festplatten-Scanner, externe Filterrad und seine EMCCD Kamera (Roper Scientific-Photometrics, Tucson, AZ) zusammengesetzt sind fest mit einer Bodenplatte aus Aluminium auf einem Silizium-Pad erforderlich zur Schwingungsdämpfung angebracht verbunden. Das konfokale Scanner verbindet mit dem Mikroskop durch einen Flansch mit einem profilierten Kragen, der aus dem Mikroskop bei AFM-Messungen können entkoppelt werden, so dass keine Vibrationen von der Spinnerei-Disk-Scanner wird die AFM-Messungen beeinflussen. Ein Argon-Krypton-Laser (Spectra Physics, Mountain View, CA) als Anregungsquelle für TIRF und konfokale Bildgebung Modi verwendet, und kann alternativ in zwei optische Fasern, die den Laser liefern die TIRF-Anlage oder der Abtastkopf gekoppelt werden, bzw. . Zwei Computer die Steuerung des Systems: Slidebook Software steuert die optische Bildgebung und Nanoscope Software steuert die AFM.
2. Cell Culture
Lebende Zellen, die GFP-Konstrukte gezielt gegen bestimmte Proteine sollten in einem Glasboden Zellkulturschale platziert 24 Stunden vor der mechanische Stimulation Experiment sein. Am Tag des Experiments ersetzen Zellkulturmedium mit Phenolrot-freiem Medium. Die Zellkulturschale auf der AFM Bühne mit einer magnetischen Kragen befestigt.
3. AFM-Spitze Vorbereitung und Mikroskop Set-up
Die AFM-Spitze mit einem 2-Mikron angepasst biotinylierten Glasperlen fünfmal mit DPBS gewaschen und dann inkubiert 5 min mit Avidin (1 mg / ml), erneut gewaschen mit DPBS fünfmal gewaschen und danach 5 min mit 1 mg / mL biotinylierten Fibronektin. Die Spitze wird noch fünfmal am Ende 2 gewaschen werden, montiert auf dem AFM-Scanner, und dann die schützende Silizium Rock wird rund um die Halter platziert werden. Set dem Mikroskop für Video-Anzeigen auf der AFM-Spitze in der Mitte des Sichtfeldes auszurichten. Richten Sie die optischen Hebel, indem der Laserstrahl am Ende des Auslegers, und ändern Sie das Ziel, eine hohe Vergrößerung Ziel richtige für Einzel-cell imaging. Die Federkonstante der Spitze hat vor dem Start des Experiments bestimmt werden. Dieser Parameter wird unter Verwendung der thermischen tune-Methode in den Nanoscope Software. Wechseln Sie von Videokamera auf EMCCD Kamera für Fluoreszenz Imaging ermöglichen. Dann wählen Sie eine Zelle und bringen die AFM-Spitze in Kontakt mit dieser bestimmten Zelle. Nach 20 min Wartezeit, die für eine starke fokale Adhäsion an der AFM Berührungspunkt mit der Zelloberfläche Form ist, wird die mechanische Stimulation zu starten.
4. Mechanische Stimulation des Live Cell
TIRF Bildgebung 3-4 wird die Methode der Wahl für die Visualisierung und Quantifizierung von fokalen Adhäsionen, und Spinning-Disk-konfokale Abbildung 5 wird für die Visualisierung des Aktin-Zytoskeletts während der Zellkörper verwendet werden. Die AFM 6 wird in contact mode Imaging unter Flüssigkeit verwendet werden.
Ein TIRF oder konfokalen Bild der Zelle wird vor Beginn der mechanische Stimulation Verfahren erworben werden. Die mechanische Stimulation wird durch die funktionalisierte AFM-Sonde, die nach oben wird in diskreten Schritten verschoben werden alle 3-5 min über einen Zeitraum von Zeit (1-1.5 Stunden) induziert werden. Die Zelle reaktive-Reaktion wird kontinuierlich in Nanoscope Software als eine Reihe von hoch Bilder, jede Linie im Bild entspricht einer Zeiteinheit von 1 Sekunde aufgezeichnet werden. Während den Erwerb der AFM-Daten, überwacht der Betreiber jederzeit die z-Position der AFM-Spitze, um das richtige Timing für den nächsten Zug zu ermitteln.
Nach jeder mechanische Stimulation ist es möglich, eine TIRF oder konfokalen Bild der Zelle in Slidebook Software erwerben, während er kontinuierlich den Erwerb AFM-Daten. Die optischen Bilder können off-line verarbeitet werden, um Filme, die Aktin-Zytoskelett und fokalen Adhäsionen Reorganisation zeigen zu schaffen. Darüber hinaus kann jedes Bild quantitativ verarbeitet werden, um Zellfläche, spezifische Protein-Bereich zu ermitteln und analysieren die allgemeine Morphologie der Zellen.
Am Ende des Experiments die AFM-Spitze aus der Zelle und AFM-Spitze Empfindlichkeit zurückgenommen wird, wird in der Nanoscope Software gemessen werden.
Das Experiment ist sehr Lärm empfindlich! Alle reden oder Mikroskop zu berühren bei der ExExperiment sollte vermieden werden. Zur Minimierung der Lärm in der AFM-Messungen sollte der Spinn-disk konfokalen vom Mikroskop entkoppelt werden. Die Wartezeit auf eine starke fokale Adhäsion zwischen Zelloberfläche und die AFM-Spitze bilden kann je nach verwendetem Zelltyp und der Matrix beschichtet an der Spitze.
5. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Gleiche glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC) mit Aktin-mRFP und Vinculin-GFP transfiziert wurde durch abgebildet: (A) AFM an der apikalen Zelloberfläche; (B) TIRF am basalen Zelloberfläche, und (C) Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie in der gesamten Zellkörper. Das konfokale Bild wird als maximale Projektion eines 3-D-Stack gezeigt. Gute Überschneidungen zwischen den AFM-und TIRF oder Spinnen-Disk-konfokale Bilder sind in (D) und (E), jeweils dargestellt. Bildgröße beträgt 64 x 50 micron.
Abbildung 2. Ein VSMC mit Aktin-mRFP transfiziert wurde mechanisch durch die AFM angeregt und abgebildet durch Spinnen-disk konfokale Mikroskopie Die Pfeile zeigen Aktinfasern dass:. (A) polymerisieren / verdicken, (b) Depolymerisation / verschwinden, oder (c) bündeln durch an Aktin Umstrukturierung. Weiß gestrichelte Linien stellen die AFM-Spitze über die Zelle. Bildgröße 91 x 91 micron.
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Discussion
Zytoskelett 7-10 und 11-16 fokalen Adhäsionen sind dynamische Strukturen, die, montieren verteilen und umdrehen, wie Zellen wandern oder reagieren auf mechanische Kraft 17. Sie haben wichtige Funktionen bei der Regulation des Zellwachstums, das Überleben und die Genexpression. Das Wissen ihrer spezifischen Verteilung und Dynamik ermöglicht ein besseres Verständnis, wie Zellen mit der Matrix und untereinander zu kommunizieren.
Das neue Mikroskop-System ist breit anwendbar für eine Vielzahl von molekularen dynamischen Studien in anhaftendem lebenden Zellen. Die integrierte Mikroskop ermöglicht quantitative Überwachung der schnellen sub-zellulären Veränderungen und bietet eine wichtige neue Werkzeug für das Verständnis der grundlegenden Prozess der zellulären Umbau in Reaktion auf die mechanische Kraft.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Vinculin-GFP-Plasmid war ein Geschenk von Kenneth Yamada, National Institutes of Health, National Institute of Dental und kraniofaziale Research, Bethesda, Maryland, und Aktin-mRFP Plasmid war ein Geschenk von Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, Florida.
Diese Arbeit wurde von der NSF Career Award # 0747334 und AHA-National SDG # 0835205N zu Andreea Trache unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
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