Summary
Este trabalho tem como objetivo instruir o leitor na operação de um sistema integrado de força atômica-microscópio óptico de imagem para a estimulação mecânica de células vivas em cultura. Um protocolo passo a passo é apresentado. Um representante conjunto de dados que mostra a resposta de células vivas ao estímulo mecânico é apresentado.
Abstract
Para entender o mecanismo pelo qual as células vivas sentido forças mecânicas, e como eles reagem e se adaptam ao seu ambiente, uma nova tecnologia capaz de investigar o comportamento de células em sub-nível celular com resolução espacial e temporal alta foi desenvolvido. Assim, um microscópio de força atômica (AFM) foi integrado com um total reflexão interna de fluorescência microscopia (TIRF) e velocidade de rotação do disco (FSD) microscopia confocal. O sistema integrado é amplamente aplicável em uma ampla gama de estudos de dinâmica molecular em qualquer células aderentes ao vivo, permitindo que imagens ópticas direta de respostas das células ao estímulo mecânico em tempo real. Reorganização significativa dos filamentos de actina e aderências focal foi mostrado devido à estimulação mecânica local na superfície da célula apical, que induziu alterações na estrutura celular em todo o corpo da célula. Estas técnicas inovadoras irá fornecer novas informações para a compreensão de reestruturação de células vivas e dinâmicas em resposta à força mecânica. Um protocolo detalhado e um conjunto de dados representativos que mostram a resposta de células vivas ao estímulo mecânico são apresentados.
Protocol
1. Visão Geral do Sistema Integrado de Microscopia
O sistema de microscópio que é usado para estes estudos tem sido descrito em detalhe 1. Resumidamente, um microscópio invertido Olympus IX-81 com TIRF anexo (Olympus, Center Valley, PA) é combinado com CSU-22 Yokogawa cabeça de leitura (Yokogawa Electric Inc, Japão). A Bioscope SZ microscópio de força atômica (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) é montado em cima do microscópio óptico invertido, e todo o sistema é colocado em cima de uma mesa de grade de pesquisa óptico (Newport, Irvine, CA).
A montagem confocal compostas a partir da verificação do disco de fiação, roda de filtros externos e sua câmera EMCCD (Roper Scientific-fotométricos, Tucson, AZ) são rigidamente conectados com uma placa base de alumínio colocada sobre uma almofada de silício necessária para amortecimento de vibrações. O scanner confocal se conecta com o microscópio através de uma flange com um colar treaded que pode ser dissociado do microscópio AFM durante as medições, de forma que nenhuma vibração do scanner disco girando vai afetar as medidas AFM. Um laser de argônio-Krypton (Spectra Physics, Mountain View, CA) é usado como fonte de excitação para ambos TIRF e modos de imagem confocal, e podem ser acoplados, em alternativa, duas fibras ópticas que entregar a laser para o acessório TIRF ou a cabeça de leitura, respectivamente . Dois computadores de controle do sistema: Slidebook software controla a imagem óptica e software Nanoscope controla o AFM.
2. Cultura de células
Células vivas expressando GFP constrói direcionados contra proteínas específicas deve ser colocado em um copo placa de cultura de células de fundo 24 horas antes do experimento de estimulação mecânica. No dia do experimento substituir o meio de cultura celular com o meio-vermelho de fenol livre. O prato de cultura de células é montado no palco AFM com um colar magnético.
3. Dica AFM Preparação e Microscópio Set-up
A ponta do AFM personalizado com um micron 2 biotinilado conta de vidro vai ser lavadas cinco vezes com DPBS e em seguida incubadas 5 min com avidina (1 mg / ml), lavado novamente com DPBS cinco vezes, e em seguida incubadas 5 min com 1 mg / mL biotinilado fibronectina. A dica vai ser lavadas cinco vezes mais no final 2, montada no scanner AFM, e então a saia de silicone de proteção serão colocadas ao redor do portador. Definir o microscópio para visualização de vídeo para alinhar a ponta do AFM no centro do campo de visão. Alinhar a alavanca óptica, colocando o feixe de laser no final do cantilever e altere o objetivo de um objetivo de alta ampliação adequada para imagens de células individuais. A constante da mola da ponta deve ser determinado antes de iniciar o experimento. Esse parâmetro será medido através do método sintonia térmica disponível no software Nanoscope. Mudar de câmera de vídeo para câmera EMCCD para permitir imagens de fluorescência. Em seguida, escolha uma célula e trazer a ponta do AFM em contato com essa célula específica. Após 20 min tempo de espera, que é necessário para uma forte adesão focal para formar no ponto de AFM de contacto com a superfície da célula, o procedimento de estimulação mecânica será iniciado.
4. A estimulação mecânica da Célula Viva
TIRF imagem 04/03 será o método de escolha para a visualização e quantificação de aderências focal, e girando-disk confocal imagem 5 será usado para visualizar o citoesqueleto de actina em todo o corpo celular. O AFM 6 vai ser usado em modo de imagem de contato com líquidos.
Uma imagem TIRF ou confocal da célula será adquirido antes de iniciar o procedimento de estimulação mecânica. A estimulação mecânica será induzido pela sonda AFM funcionalizados que será movido para cima em passos discretos cada 3-5 min ao longo de um período de tempo (1-1,5 horas). A célula reativa-resposta será gravada continuamente em software Nanoscope como uma série de imagens de altura, cada linha na imagem que representa uma unidade de tempo de 1 seg. Enquanto a aquisição dos dados AFM, o operador monitores em todas as vezes o z-posição da ponta do AFM para determinar o momento adequado para a atração seguinte.
Após cada estimulação mecânica é possível adquirir uma imagem TIRF ou confocal da célula em Slidebook software, enquanto a aquisição de dados continuamente AFM. As imagens ópticas podem ser processadas off-line para criar filmes que mostram citoesqueleto de actina e reorganização aderências focal. Além disso, cada imagem pode ser processado para determinar quantitativamente área de células, área de proteína específica, e analisar a morfologia das células em geral.
No final do experimento a ponta do AFM é retirado da cela e sensibilidade da ponta AFM será medido no software Nanoscope.
O experimento é muito sensíveis ao ruído! Qualquer falar ou tocar em microscópio durante o exmentam devem ser evitados. Para minimizar o ruído nas medidas AFM, o confocal de disco de fiação deve ser dissociado do microscópio. O tempo de espera para formar uma forte adesão focal entre a superfície da célula e a ponta do AFM pode variar dependendo do tipo celular utilizado e as revestidas de matriz na ponta.
5. Resultados representante
Figura 1. Mesma célula muscular lisa vascular (VSMC) transfectadas com actina-MRFP e vinculina-GFP foi fotografada por: (A) AFM na superfície da célula apical; (B) TIRF na superfície da célula basal e (C) A microscopia confocal girando em disco em todo o corpo celular. A imagem confocal é mostrado como projeção máxima de uma pilha de 3-D. Sobrepõe boa entre o AFM e TIRF ou girando-disk imagens são mostradas em confocal (D) e (E), respectivamente. Tamanho da imagem é de 64 x 50 mícron.
Figura 2. A VSMC transfectadas com actina-MRFP era mecanicamente estimulada pela AFM e fotografada por fiação de disco microscopia confocal As setas indicam as fibras de actina que:. (A) polimerizar / engrossar, (b) despolimerizar / desaparecer, ou (c) pacote em conjunto, devido para a reestruturação da actina. Linhas brancas tracejadas representam a ponta do AFM acima da célula. Tamanho da imagem 91 x 91 micron.
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Discussion
Aderências citoesqueleto 10/07 e 16/11 focal são estruturas dinâmicas que montar, dispersar e virar as células migram ou responder a força mecânica 17. Eles têm funções importantes na regulação do crescimento celular, sobrevivência e expressão gênica. Sabendo sua distribuição e dinâmicas específicas fornece uma melhor compreensão de como as células se comunicam com a matriz e entre si.
Este sistema novo microscópio é amplamente aplicável em uma ampla gama de estudos de dinâmica molecular em qualquer células aderentes ao vivo. O microscópio integrado permite o monitoramento quantitativo de rápida sub-celular alterações e fornece uma nova ferramenta importante para compreender o processo fundamental de remodelação celular em resposta à força mecânica.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Vinculina-GFP plasmídeo foi um presente de Kenneth Yamada, National Institutes of Health, Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial, Bethesda, Maryland, e actina-MRFP plasmídeo foi um presente de Michael Davidson, Universidade Estadual da Flórida, Tallahassee, Florida.
Este trabalho foi financiado pela NSF Prémio Carreira # 0747334 e AHA-Nacional SDG # 0835205N a Andreea Trache.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
