Summary
Este documento tiene como objetivo instruir al lector en la operación de una fuerza integrada atómica microscopio óptico de imagen para la estimulación mecánica de las células vivas en la cultura. Un protocolo de paso a paso se presenta. Un conjunto representativo de datos que muestra la respuesta de células vivas a la estimulación mecánica se presenta.
Abstract
Para entender el mecanismo por el cual las células vivas sentido las fuerzas mecánicas, y cómo responden y se adaptan a su medio ambiente, una nueva tecnología capaz de investigar el comportamiento de las células a nivel subcelular con alta resolución espacial y temporal se ha desarrollado. Por lo tanto, un microscopio de fuerza atómica (AFM) se integró con la reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía y el disco de giro rápido (FSD) microscopía confocal. El sistema integrado es ampliamente aplicable a través de una amplia gama de estudios moleculares dinámicos en cualquier célula viva adherente, permitiendo una imagen óptica directa de las respuestas celulares a la estimulación mecánica en tiempo real. Reorganización significativa de los filamentos de actina y adhesiones focales se demostró debido a la estimulación mecánica local en la superficie celular apical que los cambios inducidos en la estructura celular en todo el cuerpo celular. Estas técnicas innovadoras que proporcionan nueva información para la comprensión de la reestructuración de células vivas y dinámicas, en respuesta a una fuerza mecánica. Un protocolo detallado y un conjunto de datos representativos que muestran la respuesta de células vivas a la estimulación mecánica se presentan.
Protocol
1. Panorámica del sistema de microscopio integrado
El sistema de microscopio que se utiliza para estos estudios se ha descrito en detalle 1. En pocas palabras, un invertido Olympus IX-81 con microscopio TIRF adjunto (Olympus, Center Valley, PA) se combina con la CSU-22 Yokogawa cabeza de lectura (Yokogawa Electric Inc, Japón). Un microscopio de fuerza atómica Bioscope SZ (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) está montado en la parte superior del microscopio invertido óptica, y todo el sistema se coloca en la parte superior de una tabla de grados de investigación óptica (Newport, Irvine, CA).
El montaje confocal compuesta desde el escáner girar el disco, rueda de filtros externos y su cámara EMCCD (Roper Científico-Fotometría, Tucson, AZ) están rígidamente conectados con una placa base de aluminio colocado en una plataforma de silicio necesario para la amortiguación de las vibraciones. El escáner confocal se conecta con el microscopio a través de una brida con un collar de recauchutados que se puede separar de un microscopio AFM durante las mediciones, de tal manera que ninguna vibración del escáner girando el disco va a afectar a las mediciones de AFM. Un láser de argón-criptón (Spectra Physics, Mountain View, CA) se utiliza como fuente de excitación para ambos TIRF y modos de microscopía confocal, y se puede acoplar alternativamente en dos fibras ópticas que ofrecen el láser para la unión TIRF o el cabezal, respectivamente . Dos equipos de control del sistema: Slidebook software controla la formación de imágenes ópticas y software Nanoscope controla la AFM.
2. Cultivo de células
Las células vivas que expresan GFP construcciones dirigidas contra las proteínas específicas se deben colocar en un plato con fondo de cristal de cultivo celular 24 horas antes de la prueba de estimulación mecánica. En el día del experimento sustituir el medio de cultivo celular con rojo fenol libre de soporte. La placa de cultivo celular se monta en la etapa de AFM con un collar magnético.
3. AFM Consejo Preparación y Microscopio Set-up
La punta del AFM personalizar con una de 2 micrones biotinilado de perlas de vidrio se lavaron cinco veces con DPBS y luego se incubaron 5 minutos con avidina (1 mg / ml), se lavan nuevamente con DPBS cinco veces, y luego se incubaron 5 minutos con 1 mg / ml biotinilado fibronectina. La punta se lavaron cinco veces más en el extremo 2, montado en el escáner AFM, y luego la falda protectora de silicona se coloca alrededor de la titular. Ajuste el microscopio para ver vídeo para alinear la punta del AFM en el centro del campo de visión. Alinear la palanca óptica colocando el rayo láser en el extremo de la viga, y luego cambiar el objetivo a un objetivo de gran aumento adecuado de imágenes de células individuales. La constante del resorte de la punta tiene que ser determinada antes de comenzar el experimento. Este parámetro se mide utilizando el método de ajustar las características térmicas disponibles en el software Nanoscope. Interruptor de la cámara de vídeo a la cámara EMCCD para permitir la formación de imágenes de fluorescencia. A continuación, seleccione una celda y poner la punta del AFM en contacto con la celda en cuestión. Después de un tiempo de 20 minutos de espera, que es necesaria para una fuerte adhesión focal para formar en el punto de AFM de contacto con la superficie de la célula, el procedimiento de estimulación mecánica se inicia.
4. La estimulación mecánica de las células vivas
TIRF 3-4 imagen será el método de elección para la visualización y cuantificación de las adhesiones focales, y girando el disco de imagen confocal 5 será utilizado para la visualización del citoesqueleto de actina a través del cuerpo celular. La AFM 6 se utilizará en el modo de imagen de contacto con el líquido.
Una imagen TIRF o confocal de la célula se adquirió antes de iniciar el procedimiento de estimulación mecánica. La estimulación mecánica será inducida por la sonda de AFM funcionalizada que se mueve hacia arriba en pasos discretos cada 3-5 minutos durante un período de tiempo (1 a 1,5 horas). La célula reactiva de respuesta se grabará continuamente en software Nanoscope como una serie de imágenes de altura, cada línea de la imagen que representa una unidad de tiempo de 1 seg. Mientras que la adquisición de los datos de AFM, el operador controla en todo momento el z-posición de la punta del AFM para determinar el momento adecuado para la atracción de la próxima.
Después de cada estimulación mecánica es posible adquirir una imagen TIRF o confocal de la celda en Slidebook software, mientras continua la adquisición de datos AFM. Las imágenes ópticas pueden ser procesados off-line para crear películas que muestran la reorganización del citoesqueleto de actina y las adhesiones focales. Además, cada imagen puede ser procesada para determinar cuantitativamente área de la celda, la zona de proteínas específicas, y analizar la morfología de las células en general.
Al final del experimento se retira la punta del AFM de la célula y la sensibilidad de la punta del AFM se medirá en el software Nanoscope.
El experimento es muy sensible al ruido! Cualquier conversación o un microscopio de tocar durante la experiment debe ser evitado. Para minimizar el ruido en las mediciones de AFM, el confocal girar el disco debe ser disociado del microscopio. El tiempo de espera para formar una fuerte adhesión focal entre la superficie de la célula y la punta del AFM puede variar dependiendo del tipo de células utilizadas y el revestimiento de la matriz en la punta.
5. Resultados representante
Figura 1. Mismas células del músculo liso vascular (CMLV) transfectadas con actina-mRFP y vinculina GFP-fue fotografiada por: (A) AFM en la superficie celular apical (B) TIRF en la superficie de células basales, y (C) girando el disco de microscopía confocal en todo el cuerpo de la célula. La imagen confocal se muestra como la proyección máxima de una pila de 3-D. Solapamientos entre las buenas y AFM TIRF o girar imágenes de disco confocal se muestran en (D) y (E), respectivamente. Tamaño de la imagen es de 64 x 50 micras.
Figura 2. A las CMLV transfectadas con actina-mRFP fue estimulado mecánicamente por la AFM y la imagen haciendo girar el disco microscopía confocal Las flechas indican las fibras de actina que:. (A) polimerizar / espesar, (b) despolimerizar / desaparecer, o (c) paquete en conjunto debido a la reestructuración de la actina. Las líneas blancas discontinuas representan la punta del AFM encima de la celda. La imagen a tamaño 91 x 91 micras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adherencias citoesqueleto 07.10 y focal 11-16 son estructuras dinámicas que reúnen, se dispersan y vuelta como las células migran o responder a la fuerza mecánica 17. Tienen funciones importantes en la regulación del crecimiento celular, la supervivencia, y la expresión génica. Conocer su distribución específica y la dinámica proporciona una mejor comprensión de cómo se comunican las células con la matriz y entre ellos.
Este sistema nuevo microscopio es ampliamente aplicable a través de una amplia gama de estudios moleculares dinámicos en las células viven adheridas. El microscopio integrado permite el seguimiento cuantitativo de los rápidos cambios subcelulares y proporciona una nueva herramienta importante para entender el proceso fundamental de la remodelación celular en respuesta a una fuerza mecánica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Plásmido vinculina-GFP fue un regalo de Kenneth Yamada, Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial, Bethesda, Maryland, y la actina mRFP plásmido fue un regalo de Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, Florida.
Este trabajo fue apoyado por el premio de su carrera NSF # 0747334 y AHA-Nacional SDG # 0835205N a Andreea Trache.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
