Summary
Ce document vise à instruire le lecteur dans le fonctionnement d'un système intégré à force atomique, microscope optique d'imagerie pour la stimulation mécanique des cellules vivantes en culture. Un protocole étape par étape est présentée. Un ensemble représentatif de données qui montre la réponse de cellules vivantes à la stimulation mécanique est présenté.
Abstract
Pour comprendre le mécanisme par lequel les cellules vivantes sens des forces mécaniques, et comment ils réagissent et s'adaptent à leur environnement, une nouvelle technologie capable de d'étudier le comportement des cellules au niveau sub-cellulaire avec une résolution spatiale et temporelle élevée a été développé. Ainsi, un microscope à force atomique (AFM) a été intégré à la réflexion interne totale de fluorescence (FRBR) microscopie et rotation rapide du disque (DSE) microscopie confocale. Le système intégré est largement applicable dans un large éventail d'études moléculaires dynamiques dans toute cellules adhérentes en direct, permettant d'imagerie optique directe des réponses des cellules à la stimulation mécanique en temps réel. Réarrangement significatif des filaments d'actine et adhésions focales a été montré en raison de la stimulation mécanique locale à la surface cellulaire apicale qui induit des changements dans la structure cellulaire dans le corps cellulaire. Ces techniques innovantes fournira de nouvelles informations pour comprendre la restructuration de cellules vivantes et dynamiques en réponse à une force mécanique. Un protocole détaillé et un ensemble de données représentatives que la réponse cellulaire spectacle à la stimulation mécanique sont présentées.
Protocol
1. Présentation du système de microscope intégré
Le système de microscope qui est utilisé pour ces études a été décrite en détail 1. En bref, une inversé Olympus IX-81 microscope TIRF attachement (Olympus, Center Valley, Pennsylvanie) est combiné avec la CSU-22 Yokogawa numérisation tête (Yokogawa Electric Inc, Japon). Un microscope à force atomique Bioscope SZ (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, Californie) est monté sur le dessus du microscope optique inversé, et l'ensemble du système est placé sur le dessus d'une table de qualité optique de recherche (Newport, Irvine, CA).
Le montage confocale composé à partir du scanner tourne-disque, roue à filtres externes et sa caméra EMCCD (Roper Scientific-Photometrics, Tucson, AZ) sont solidaires d'une plaque de base en aluminium placée sur un coussin de silicium nécessaire à l'amortissement des vibrations. Le scanner se connecte confocale avec le microscope grâce à une bride avec un collier qui peut être foulé découplé du microscope lors des mesures AFM, telle qu'aucune vibration du scanner tourne-disque aura une incidence sur les mesures AFM. Un laser argon-krypton (Spectra Physics, Mountain View, CA) est utilisé comme source d'excitation pour les deux FRBR et les modes d'imagerie confocale, et peut être couplé alternativement dans deux fibres optiques qui offrent le laser à l'attachement FRBR ou la tête de balayage, respectivement . Deux ordinateurs de contrôle du système: un logiciel de contrôle Slidebook l'imagerie optique et un logiciel de contrôle Nanoscope l'AFM.
2. Culture de cellules
Les cellules vivantes exprimant la GFP des constructions ciblées contre des protéines spécifiques doivent être placés dans un plat en verre à fond la culture de cellules 24 heures avant l'expérience de stimulation mécanique. Le jour de l'expérience de remplacer le milieu de culture cellulaire avec du phénol rouge sans moyen. La boîte de culture cellulaire est monté sur la scène AFM avec un collier magnétique.
3. AFM Astuce Préparation et Microscope Set-up
La pointe AFM personnalisé avec un micron 2 biotinilés billes de verre seront lavées cinq fois avec du DPBS et ensuite incubées 5 min avec l'avidine (1 mg / ml), lavé à nouveau avec du DPBS cinq fois, puis incubées 5 min à 1 mg / mL biotinilés fibronectine. La pointe sera lavé cinq fois plus à la fin 2, monté sur le scanner AFM, puis la jupe de protection en silicone sera placé autour du support. Régler le microscope pour visionner des vidéos d'aligner la pointe AFM dans le centre du champ de vue. Aligner le levier optique en plaçant le faisceau laser à la fin du cantilever, puis modifier l'objectif d'un objectif à fort grossissement approprié pour l'imagerie cellulaire unique. La constante du ressort de la pointe doit être déterminé avant de commencer l'expérience. Ce paramètre sera mesuré en utilisant la méthode de réglage thermique disponible dans le logiciel Nanoscope. Commutateur de caméra vidéo pour caméra EMCCD pour permettre l'imagerie de fluorescence. Ensuite, choisissez une cellule et amener la pointe AFM en contact avec cette cellule spécifique. Après 20 min de temps d'attente, ce qui est nécessaire pour une forte adhérence focale pour former au point de l'AFM de contact avec la surface des cellules, la procédure de stimulation mécanique va commencer.
4. Stimulation mécanique des cellules vivantes
FRBR 3-4 imagerie sera la méthode de choix pour la visualisation et la quantification des adhérences focales, et le filage du disque imagerie confocale 5 sera utilisé pour visualiser le cytosquelette d'actine dans tout le corps cellulaire. L'AFM 6 sera utilisé en imagerie mode de contact sous fluide.
Une image TIRF ou confocale de la cellule va être acquis avant de commencer la procédure de stimulation mécanique. La stimulation mécanique sera induite par la sonde AFM fonctionnalisées qui sera déplacé vers le haut par étapes discrètes tous les 3-5 min sur une période de temps (1-1,5 heure). La cellule réactive-réponse sera enregistré en continu dans les logiciels Nanoscope comme une série d'images de hauteur, chaque ligne de l'image représentant une unité de temps de 1 sec. Alors que l'acquisition des données AFM, l'opérateur surveille en tout temps, le z-position de la pointe AFM pour déterminer le moment approprié pour l'attraction suivante.
Après chaque stimulation mécanique, il est possible d'acquérir une image TIRF ou confocale de la cellule dans Slidebook logiciels, tout en continuant à acquérir des données de l'AFM. Les images optiques peuvent être traitées hors ligne pour créer des films qui montrent cytosquelette d'actine et la réorganisation focale adhérences. En outre, chaque image peut être traitée afin de déterminer quantitativement surface cellulaire, la zone de protéines spécifiques, et d'analyser la morphologie cellulaire en général.
A la fin de l'expérience de la pointe AFM est retirée de la cellule et la sensibilité pointe AFM seront mesurés dans le logiciel Nanoscope.
L'expérience est très sensible au bruit! Toute parler ou de microscope toucher pendant l'expérience devrait être évitée. Afin de minimiser le bruit dans les mesures AFM, l'confocale à disque rotatif doit être découplée de la loupe. Le temps d'attente pour former une forte adhésion focale entre la surface des cellules et la pointe de l'AFM peut varier en fonction du type cellulaire utilisé et le revêtement de matrice à la pointe.
5. Les résultats représentatifs
Figure 1. Idem cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) transfectées avec l'actine et RDRF vinculine-GFP a été imagée par: (A) l'AFM à la surface cellulaire apicale; (B) la FRBR à la surface des cellules basales et (C) tourne-disque microscopie confocale partout dans le corps cellulaire. L'image confocale est montré que la projection maximale d'une pile en 3-D. Bonne chevauchements entre l'AFM et de la FRBR ou le filage des images de disque confocale sont présentés dans (D) et (E), respectivement. Taille de l'image est de 64 x 50 microns.
Figure 2. Un CMLV transfectées avec l'actine-RDRF était mécaniquement stimulées par l'AFM et imagée par disque rotatif microscopie confocale Les flèches indiquent que les fibres d'actine.: (A) polymériser / épaissir, (b) dépolymériser / disparaître, ou (c) bundle ensemble en raison à la restructuration de l'actine. Blanc lignes pointillées représentent la pointe de l'AFM-dessus de la cellule. Taille de l'image 91 x 91 microns.
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Discussion
Adhérences Cytosquelette 7-10 et 11-16 focale sont des structures dynamiques qui s'assemblent, se dispersent et retournent comme des cellules migrent ou répondre à une force mécanique 17. Ils ont des fonctions importantes dans la régulation de la croissance cellulaire, la survie et l'expression des gènes. Connaissant leur distribution spécifique et de la dynamique permet de mieux comprendre comment les cellules communiquent avec la matrice et entre eux.
Ce système nouveau microscope est largement applicable dans un large éventail d'études moléculaires dynamiques dans toute cellules adhérentes en direct. Le microscope intégré permet un suivi quantitatif de rapides changements sub-cellulaire et fournit un outil de nouvelle importante pour comprendre les processus fondamentaux de remodelage cellulaire en réponse à une force mécanique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Plasmidique vinculine-GFP a été un cadeau de Kenneth Yamada, National Institutes of Health, Institut national de recherche dentaire et craniofaciale, Bethesda, Maryland, et l'actine-MRFP plasmide a été un cadeau de Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, en Floride.
Ce travail a été soutenu par la NSF Career Award # 0747334 et AHA-National SDG # 0835205N d'Andreea Trache.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
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