Summary
Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.
Abstract
Om te begrijpen het mechanisme waarmee levende cellen zin mechanische krachten, en hoe ze reageren en zich aanpassen aan hun omgeving, een nieuwe technologie in staat om cellen gedrag te onderzoeken op sub-cellulair niveau met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie is ontwikkeld. Zo werd een atomic force microscoop (AFM) geïntegreerd met een totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie en snel draaiende schijf (FSD) confocale microscopie. Het geïntegreerde systeem is breed toepasbaar in een breed scala van moleculaire dynamische studies in alle aanhangend levende cellen, waardoor de directe optische beeldvorming van de cel responsen aan mechanische stimulatie in real-time. Belangrijke herschikking van de actine filamenten en focale adhesies bleek te wijten aan de lokale mechanische stimulatie bij de apicale celoppervlak dat veranderingen veroorzaakt in de cellulaire structuur in de cel lichaam. Deze innovatieve technieken zal nieuwe informatie voor inzicht in levende cellen herstructurering en dynamiek in reactie op mechanische kracht. Een gedetailleerd protocol en een representatieve dataset te tonen dat levende cellen als reactie op mechanische stimulatie worden gepresenteerd.
Protocol
1. Overzicht van het Integrated System microscoop
De microscoop systeem dat wordt gebruikt voor deze studies is in detail beschreven: 1. Kortom, is een omgekeerde Olympus IX-81 microscoop met TIRF bijlage (Olympus, Center Valley, PA) in combinatie met CSU-22 Yokogawa aftastkop (Yokogawa Electric Inc, Japan). Een Bioscope SZ atomic force microscoop (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) is gemonteerd op de top van de optische omgekeerde microscoop, en het hele systeem is geplaatst op de top van een onderzoeks-kwaliteit optische tafel (Newport, Irvine, CA).
De confocale samenstel dat is opgebouwd uit de draaiende schijf scanner, externe filter wiel en de EMCCD camera (Roper Scientific-Photometrics, Tucson, AZ) zijn vast verbonden met een aluminium bodemplaat geplaatst op een siliconen pad nodig is voor trillingsdemping. De confocale scanner verbindt met de microscoop via een flens met een Treaded kraag die kan van de microscoop worden losgekoppeld tijdens het AFM-metingen, zodanig dat er geen trillingen van de draaiende schijf scanner zal de AFM metingen beïnvloeden. Een Argon-laser Krypton (Spectra Physics, Mountain View, CA) wordt gebruikt als excitatie bron voor zowel TIRF en confocale imaging modes, en kan als alternatief worden gekoppeld in twee optische vezels die de laser te leveren aan de TIRF bijlage of het scannen hoofd, respectievelijk . Twee computers controle van het systeem: Slidebook software regelt de optische beeldvorming en NanoScope software controleert de AFM.
2. Cel Cultuur
Live-cellen die GFP constructen gericht tegen specifieke eiwitten moeten worden geplaatst in een glazen bodem celkweek schaal 24 uur voorafgaand aan de mechanische stimulatie experiment. Op de dag van het experiment vervanging van de celkweekmedium met fenol rood-vrij medium. De cel cultuur schotel is gemonteerd op de AFM podium met een magnetische kraag.
3. AFM Tip Voorbereiding en Microscoop Set-up
De AFM tip aangepast met een 2 micron biotinilated glas kraal zal vijf keer worden gewassen met DPBS en dan geïncubeerd 5 min met avidine (1 mg / ml), gewassen weer met DPBS vijf keer, en vervolgens geïncubeerd 5 min met 1 mg / ml biotinilated fibronectine. De tip zal worden gewassen vijf keer aan het eind 2, gemonteerd op de AFM scanner, en vervolgens de beschermende silicium rok zal worden geplaatst rond de houder. Zet de microscoop voor het bekijken van video aan de AFM tip in het centrum van het gezichtsveld af te stemmen. Lijn de optische hefboom door het plaatsen van de laserstraal helemaal aan het eind van de cantilever, en vervolgens de doelstelling te wijzigen in een hoge vergrotingsfactor doelstelling van een goede voor single cell imaging. De veerconstante van de punt moet worden vastgesteld vóór het begin van het experiment. Deze parameter zal worden gemeten met de thermische methode af te stemmen beschikbaar in de NanoScope software. Overschakelen van videocamera op EMCCD camera zorgen voor bloei beeldvorming. Kies vervolgens een cel en breng de AFM tip in contact met die specifieke cel. Na 20 minuten wachttijd die nodig is voor een sterke focal adhesion te vormen bij de AFM punt van contact met het celoppervlak, zal de mechanische stimulatie te starten.
4. Mechanische stimulatie van de Live Cell
TIRF imaging 3-4 wordt de methode van keuze voor het visualiseren en kwantificeren van focale adhesies zijn, en spinnen-disk confocale imaging 5 zal worden gebruikt voor het visualiseren van het actine cytoskelet in de cel lichaam. De AFM 6 zal gebruikt worden in contact-modus beeldvorming onder vloeistof.
Een TIRF of confocale beeld van de cel zal worden verkregen voordat de mechanische stimulatie procedure. De mechanische stimulatie zal worden geïnduceerd door de gefunctionaliseerde AFM sonde die naar boven zullen worden verplaatst in discrete stappen elke 3-5 minuten over een periode van tijd (1-1,5 uur). De cel-reactieve reactie zal continu worden geregistreerd in NanoScope software als een serie van hoogte foto's, elke regel in de afbeelding die een tijdseenheid van 1 sec. Terwijl het verwerven van de AFM gegevens, de operator bewaakt te allen tijde de z-positie van de AFM tip om vast te stellen de juiste timing voor de volgende te trekken.
Na elke mechanische stimulatie is het mogelijk om een TIRF of een confocale beeld van de cel in Slidebook software aan te schaffen, terwijl continu het verwerven van AFM gegevens. De optische beelden kunnen off-line worden verwerkt tot films die actine cytoskelet en focale adhesies reorganisatie zien te creëren. Ook kan elk beeld kwantitatief worden verwerkt tot cel-gebied, specifiek eiwit gebied te bepalen, en de algemene morfologie van de cel te analyseren.
Aan het eind van het experiment de AFM tip is teruggetrokken uit de cel en AFM tip gevoeligheid zal worden gemeten in de NanoScope software.
Het experiment is zeer geluidsgevoelige! Elke praten of microscoop aan te raken tijdens de niet-experiment moet worden vermeden. Om het lawaai in de AFM-metingen, moet de draaiende schijf confocale worden losgekoppeld van de microscoop. De wachttijd voor een sterk knooppunt hechting tussen het oppervlak van cellen en de AFM tip vorm kan variëren, afhankelijk van het gebruikte celtype en de matrix gecoat op de tip.
5. Representatieve resultaten
Figuur 1. Zelfde vasculaire gladde spiercellen (VSMC) getransfecteerd met actine-mRFP en vinculin-GFP werd in beeld gebracht door: (A) AFM op de apicale celoppervlak; (B) TIRF op de basale celoppervlak, en (C) spinning-disk confocale microscopie het hele cellichaam. De confocale beeld wordt weergegeven als een maximale projectie van een 3-D stack. Goed overlappingen tussen de AFM en de TIRF of spinning-disk confocale beelden worden getoond in (D) en (E), respectievelijk. Beeldformaat is 64 x 50 micron.
Figuur 2. Een VSMC getransfecteerd met actine-mRFP werd mechanisch gestimuleerd door de AFM en afgebeeld door het draaien van-disk confocale microscopie De pijlen geven aan actine vezels die:. (A) polymeriseren / dikker, (b) depolymeriseren / verdwijnen, of (c) te bundelen ten gevolge aan actine herstructurering. Witte stippellijnen staan voor de AFM tip boven de cel. Beeldformaat 91 x 91 micron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytoskelet 7-10 en 11-16 focale adhesies zijn dynamische structuren die samen te stellen, verspreiden en draai dan als cellen migreren of te reageren op mechanische kracht 17. Ze hebben belangrijke functies in het reguleren van de celgroei, overleving, en genexpressie. Het kennen van hun specifieke verdeling en dynamiek zorgt voor een beter begrip van hoe cellen communiceren met de matrix en onderling.
Dit nieuwe microscoop systeem is breed toepasbaar in een breed scala van moleculaire dynamische studies in alle aanhangend levende cellen. De geïntegreerde microscoop maakt kwantitatieve controle van een snelle sub-cellulaire veranderingen en zorgt voor een belangrijk nieuw hulpmiddel voor het begrijpen van de fundamentele proces van cellulaire remodeling in reactie op mechanische kracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Vinculin-GFP plasmide was een geschenk van Kenneth Yamada, National Institutes of Health, National Institute of Dental en Craniofaciale Onderzoek, Bethesda, Maryland, en actine-mRFP plasmide was een geschenk van Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, Florida.
Dit werk werd ondersteund door NSF Career Award # 0747334 en AHA-Nationaal SDG # 0835205N naar Andreea tranche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
