Summary
본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.
Abstract
살아있는 세포가 기계적 힘을 감지하는 메커니즘을 이해하기 위해서는, 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 하위 세포 수준에서 세포의 행동을 조사할 수있는 그들이 반응하고 환경에 적응하는 방법, 새로운 기술하는 것은 개발되었습니다. 따라서, 원자 힘 현미경 (AFM)은 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경과 고속 회전하는 디스크 (FSD) 공촛점 현미경과 통합되었습니다. 통합 시스템은 실시간으로 기계 자극에 세포 반응의 직접적인 광학 이미징을 허용, 모든 자기편 라이브 세포에서 분자 역동적인 연구 광범 광범위하게 적용됩니다. 굴지의 필라멘트와 초점 adhesions의 중요한 다시 정리하기는 인해 세포 체내 세포 구조로 변화를 유도하는 혀끝의 세포 표면에서 로컬 기계 자극을 표시했다. 이러한 혁신 기술은 기계적 강제에 대한 응답으로 사는 셀 구조 조정과 역학을 이해하는 새로운 정보를 제공합니다. 상세한 프로토콜과 대리인 데이터는 기계적 자극에 표시 라이브 셀 응답이 제공되는 설정합니다.
Protocol
1. 통합 현미경 시스템의 개요
이러한 연구에 사용되는 현미경 시스템은 상세 1에서 설명되었습니다. 간단히, TIRF 첨부 (올림푸스, 센터 밸리, PA)와 거꾸로 올림푸스 IX - 81 현미경과 결합 CSU - 22 요코 스캔 헤드 (요코 전기 병원, 일본). Bioscope SZ 원자 힘 현미경 (Veeco 인스 트루먼 트의 병원, 산타 바바라, CA)는 광학 거꾸로 현미경 위에 탑재하고, 전체 시스템은 연구 등급 광학 테이블의 상단 (뉴 포트, 어빈, CA)에 위치합니다.
회전 디스크 스캐너, 외부 필터 휠과 EMCCD 카메라 (로퍼 과학 - Photometrics, 투싼, AZ)에서 구성된 공촛점 어셈블리가 rigidly 진동 감쇠에 필요한 실리콘 패드에 위치 알루미늄베이스 플레이트와 연결됩니다. 공촛점 스캐너 AFM 측정하는 동안 현미경에서 decoupled 수 treaded 칼라와 플랜지를 통해 현미경으로 연결하는 회전 디스크 스캐너로부터 진동 AFM 측정에 영향을 미치지 않습니다 그러한. 아르곤 - 크립톤 레이저 (스펙트럼 물리학, Mountain View, CA)를 각각 TIRF 및 공촛점 이미징 모드 모두 여기 소스로 사용하고 TIRF 첨부 파일 또는 스캔 머리에 레이저를 전달이 광학 섬유에 또는 결합 수 있습니다 . 두 컴퓨터가 시스템을 제어 : Slidebook 소프트웨어는 광학 이미징을 제어하고 Nanoscope 소프트웨어는 AFM을 제어합니다.
2. 세포 배양
라이브 세포가 특정 단백질에 대한 타겟으로 GFP를 구성 표현은 24 시간 전에 기계적 자극 실험에 유리 바닥 세포 배양 접시에 배치해야합니다. 실험 당일 페놀 레드 무료 매체와 세포 배양 매체를 교체하십시오. 세포 배양 접시는 자기 칼라와 AFM 무대에 장착할 수 있습니다.
3. AFM 팁 준비 및 현미경 설정
2 마이크론과 함께 사용자 정의 AFM 팁 유리 구슬이 DPBS있는 5 번 세탁 후 아비딘 (1 MG / ML)로 5 분 incubated, DPBS 다섯번로 다시 씻어, 다음 1 MG / ML biotinilated 5 분 incubated 것입니다 biotinilated fibronectin. 팁은 끝 2에서 다섯 번 이상 씻어 AFM 스캐너에 탑재하고 보호 실리콘 스커트는 보유자 주위에 배치됩니다 것입니다. 보기의 필드의 중앙에 AFM 팁 정렬에 비디오를 볼 수 있도록 현미경을 설정합니다. 캔틸레버의 가장 끝에있는 레이저 광선을 배치하여 광학 레버를 정렬하고 단일 세포 이미징에 대한 적절한 높은 배율 목표로 목적을 변경합니다. 팁의 상수 봄 실험을 시작하기 전에 결정되어야한다. 이 매개 변수는 Nanoscope 소프트웨어에서 사용 가능한 열 조정 방법을 사용하여 측정됩니다. 개화 이미징 수 있도록 EMCCD 카메라로 비디오 카메라에서 전환합니다. 그런 다음, 셀을 선택하고 특정 세포와 접촉 AFM 팁 가져. 세포 표면과 접촉의 AFM 지점에 양식에 강한 초점 접착에 필요한 20 분 대기 시간 후, 기계적 자극 절차가 시작됩니다.
4. 라이브 세포의 기계 자극
3-4 TIRF 영상은 초점 adhesions를 시각화하고 quantifying을위한 최고의 방법되며, 방적 디스크 공촛점 이미징 5 세포 체내 굴지의 cytoskeleton을 시각화에 사용됩니다. AFM 6 유체 아래의 연락처 모드 이미징에 사용됩니다.
세포의 TIRF 또는 공촛점 이미지가 기계적 자극 절차를 시작하기 전에 취득됩니다. 기계적 자극이 일정 기간 (1-1.5 시간) 동안 매 3-5 분 이산 단계로 상향 이동됩니다 기능화 AFM 프로브에 의해 유발됩니다. 세포 반응 - 반응은 높이 이미지, 1 초 단위 시간을 나타내는 이미지의 각 라인의 시리즈로 Nanoscope 소프트웨어에 지속적으로 기록됩니다. AFM 데이터를 수집하는 동안 작업자는 항상 AFM 팁의 Z 위치는 다음 당기에 대한 적절한 타이밍을 결정하기 위해 모니터링합니다.
각각의 기계적 자극 후 지속 AFM 데이터를 획득하면서 Slidebook 소프트웨어의 세포의 TIRF 또는 공촛점 이미지를 얻을 수 있습니다. 광학 이미지는 굴지의 cytoskeleton과 초점 adhesions의 개편을 보여 영화를 만들 오프라인 처리할 수 있습니다. 또한, 각 이미지는 셀 영역, 특정 단백질 영역을 결정하고, 일반적인 세포 형태를 분석하기 위해 양적 처리할 수 있습니다.
AFM 팁은 세포와 AFM 팁 감도에서 철회되는 실험의 끝에 Nanoscope 소프트웨어에서 측정됩니다.
실험은 매우 소음 민감합니다! 전 동안 감동 아무 말도 또는 현미경periment은 피해야한다. AFM 측정에서 소음을 최소화하기 위해, 회전 디스크 공촛점는 현미경에서 드 결합해야합니다. 세포 표면과 AFM 팁 사이에 강한 초점 접착력을 형성하는 대기 시간은 사용되는 세포 유형과 끝에 매트릭스 코팅에 따라 달라질 수 있습니다.
5. 대표 결과
그림 1. 굴지 - mRFP 및 vinculin - GFP와 transfected 같은 혈관 평활근 세포 (VSMC)가로 몇 군데되었습니다 혀끝의 세포 표면에 (A) AFM, (B) 기저 세포 표면에 TIRF하며, (C) 스피닝 디스크 공촛점 현미경 세포 체내. 공촛점 이미지가 3 차원 스택의 최대 투사로 표시됩니다. AFM과 TIRF 또는 방적 디스크 공촛점 이미지 사이 좋은 중복은 (D)와 (E), 각각에 표시됩니다. 이미지 크기는 64 X 50 미크론이다.
그림 2. 굴지 - mRFP와 transfected VSMC는 기계 AFM에 의해 자극과 회전 디스크 공촛점 현미경으로 몇 군데했다 화살표 그 굴지의 섬유를 나타냅니다. (A) 진하게 / 중합, (B) depolymerize / 사라, 또는 (c) 때문에 함께 번들 굴지의 구조 조정합니다. 화이트 점선 라인은 세포 위에 AFM 팁을 나타냅니다. 이미지 크기 91 X 91 미크론.
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Discussion
Cytoskeleton 70-10과 초점 adhesions가 11-16, 조립 분산 및 세포가 마이 그 레이션 또는 기계적 강제로 17 답변으로 넘겨 역동적인 구조입니다. 그들은 세포 성장, 생존, 그리고 유전자 발현을 조절에 중요한 기능을합니다. 그들의 구체적인 유통 및 역학을 아는 것은 세포가 모체와 자신 사이의 의사 소통 방법에 대한 이해를 제공합니다.
이 새로운 현미경 시스템은 자기편 살 세포의 분자 역동적인 연구 광범 광범위하게 적용됩니다. 통합 현미경은 빠른 하위 세포 변화의 양적 모니터링을 가능하게하고 기계적인 강제에 대한 응답으로 세포 리모델링의 기본 과정을 이해하기위한 중요한 새로운 도구를 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
플라스미드 Vinculin - GFP는 마이클 데이비슨, 플로리다 주립 대학, 탤러해시, 플로리다의 선물 케네스 야마다, 플라스미드 국립 보건 연구소, 치과와 Craniofacial 연구의 국립 연구소, 베데스다, 메릴랜드, 그리고 굴지 - mRFP에서 선물했다.
이 작품은 NSF 경력 보너스 # 0747334 및 AHA - 국립 SDG # 0835205N Andreea Trache에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | |
| avidin | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
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