春雨とカッペリーニの処理試験：ラットとマウスの器用な前足の機能の簡単な定量的指標

Summary

春雨と前足の器用さのカッペリーニ処理テストは、巧みな前足と数字の動きを使って食料品を操作するための齧歯類の自然な傾斜を利用しています。未調理の乾燥パスタの短い鎖を処理している動物はビデオ撮影されています。スローモーションビデオの再生には、前足の調整の定量化が可能になります。

Abstract

行動を食べる齧歯類の前の特徴付けは、食品のピースを操作するための協調前足の動きを使用することを明らかにした。我々は、片側に障害と年齢依存性の変化に敏感な前足の器用さの単純な定量的尺度を開発するには、この作業によって拡張されています。げっ歯類は、熟練した前足と彼らは熱心に消費する細いパスタの部分を、管理するための数字の動きを学びます。我々は以前、ラットでは春雨の取り扱いを定量化するための方法を記載し、措置は一方的な虚血性病変、中大脳動脈の閉塞および片側線条体ドーパミンの枯渇[アルレッド、RP、アドキンス、DL、ウッドリー、MTから生じる前肢障害に対して非常に敏感であることが示されている夫、LC、マルドナドMA、ケイン、JR、Schallert、T.＆ジョーンズ、TA春雨処理試験：ラットの器用な前足の機能の簡単な定量的尺度。

Protocol

1。テストの開始の準備

1. 未調理のパスタの部分は、カミソリの刃を使用して長さに切断されています。ラットの場合は、スキナーブランドビーフンパスタ（1.5 mmの直径）は7cmの長さにカットされます。マウスの場合は、DeCeccoブランドカペッリーニパスタ（1.0 mmの直径が）2.6 cmの長さ（図1C）にカットされます。パスタのブランドは取り扱い方法に影響を与える可能性テクスチャと直径、それぞれに異なるため、それがパスタの単一のソースが繰り返しテストに使用することをお勧めします。
2. 新しいもの嫌いの応答を克服し、ハンドリングのスキルを確立するために、動物は、試験前に自分のホームケージでのパスタの部分に数週間で数回公開されています。 （通常は、露出の5〜10日、約4枚ずつ時間は、十分です。）
3. テストはホームケージ以外のチャンバー内に投与される場合、または自宅のケージがテストのために移動した場合、テスト環境で食べることに慣れが提供されています。 （動物はすぐにこの環境でパスタを食べれるまでには通常、3〜5セッションを取ります。）
4. 動物が熱心にパスタを受け入れるした後でも、大きなカメラは、テストエリアの隣に移動されたとき、彼らは急に寡黙になることができます。馴化セッションのいずれかまたは複数のテスト環境の前にカメラを配置しておくと便利です。
5. ほとんどの動物が行動するので、パスタが非常に嗜好性であるかのように、それは食品試験前にそれらを制限することは必須ではありません。しかし、食品の除去は、数時間前、または一晩実験者とカメラの前で食べやすく、それらがテストの時に補償されないことを保証することができる。
6. 食べる時にパスタの部分を分割すると裁判が無効になります。私達は動物を試験に用いたものよりも長いピースを与えれない場合は、この習慣が大幅に回避される発見した。
7. テストセッションのため、パスタの部分は厚紙のテンプレート（春雨とカペッリーニ鎖で0.86センチメートル刻みで1.75センチメートルの刻み）を使用して特定の間隔で微細先端のマーカーでマークされています。これは、食べる時にパスタの鎖の動きの可視化を容易にします。

2。設定したテスト

1. 動物は、ホームケージまたは無傷の、透明な壁を持つ別の装置のいずれかでテストされるべきである、と、テストセッション中にそれらのcagematesから分離する必要があります。
2. ラットを実践実験（アラリら 、2008）によってリアルタイムにテストすることができるものの、定量データがスローモーションビデオの再生中に収集できるように、ビデオ録画によって促進される。我々は彼らの足と速い動きの小さいサイズのため、スローモーションのビデオを再生することなくマウスの前足の動きを確実に定量化することが可能見つかっていない。
3. 高フレームレートと十分なズーム付きビデオカメラが使用されます。我々は、通常の部屋の照明条件で少なくとも420 S - 1のシャッタースピードに設定されて16倍ズームレンズをキヤノンXL1Sのカメラを使用してください。パンチルト頭と車輪三脚の使用は、カメラの位置決めを容易にします。
4. ラットは一般的にパスタを食べるために彼らのふんぞり返っていられるほど背筋を伸ばして座ると足が最も簡単に軽く上向きの角度（図1A）で約チャンバーの床のレベルに位置づけカメラで表示されています。削りくずとケージにテストする場合、いくつかの削りくずの除去は、ビューを最適化するために役に立つかもしれません。
5. マウスはラットに比べ角度の多くで一部を保持し、パスタを食べる時に前方に曲げる傾向がある。このように、オープンフロアでテストチャンバーは、ミラーの上に配置されます。カメラが床面よりわずかに高いレベルに配置され、ミラーの足（図の1B）の反射に焦点を下向きに傾斜している。一面のミラーを使用することは、ビデオ再生のための足の明瞭度を改善。
6. パスタピースのそれぞれの一口は、このように、オーディオの録音が食べることを検証するために便利です、音です。

3。パスタ処理試験の管理

1. テストセッションは、試験ごとに食べoneパスタ片と、シーケンシャル試験で構成されています。我々は通常、ラットとマウスの3〜4試験4〜5の試験からのデータを記録する。
2. ビデオ撮影の前に、パスタの部分は食べることを開始し、適切なカメラビューに動物を移動するためにチャンバ内に配置されます。
3. 動物がカメラに直面すると集中し、前肢と、すべての数字の両方で離散的な調整結果を表示する（〜10 - 12X）十分にズームすることが必要です。両方の足の指の関節は表示可能でなければなりません。このカメラで、少なくとも、我々は、関心領域上に狭めるために、唯一の前に裁判の開始にオートフォーカス機能を使用すると便利です。私たちは、その後、マニュアルフォーカスに切り替える。
4. とすぐに動物とカメラが位置しているとして、一審が開始されます。作品は、直接動物とレコーディングの前にドロップまたはdangledれる前に食べて発症に開始されます。
5. その後、試験は即座に連続して与えられます。動物が離れて移動しないようにそれは、試験間の遅延を最小限にすることをお勧め最適な視聴位置から。
6. 足がサイドに表示されているか、フォーカスが失われている試験は採点されていません。
7. テストセッションは、事前と事後治療的パターン（。。アラリら 、2008など、中枢神経損傷後の回復）を文書化する、例えば、日間で繰り返すことができます。
8. 課題は、カメラに対して相対的な好みの位置に食べるために動物を得てすることができます。それは試験前に数分間、カメラの存在にカメラ嫌いの動物を慣らすことが必要な場合があります。動物は、しばしば理想的な地域でパスタを落としたり、ダングリングによって所定の位置になだめすることができます。与えられた要素の数が満腹感を避けるために最小化されるべきであるけれども、それは、この目的の位置を達成するためにいくつかの部分が必要になる場合があります。
9. いくつかのラットのシーケンシャルテストのために、我々は真ん中の輪三脚のカメラで、円の中に一度に彼らのケージの数を設定すると便利な発見した。作品は、それぞれのケージの理想的な領域にドロップされ、カメラは、最初の適切な位置で食べ始まるラットに移動。これは、低速（位置に食べて）ラットのためのより多くの時間は、カメラと実験者の存在に慣れになることができますし、それらはまた、より高速なラットの痛烈な音で食べるために刺激されることがあります。

4。前足の調整の定量的なビデオ分析と食べる時間

1. 食べる時に前足の調整の分析では、ラットの中枢神経系の損傷後の片側に障害の影響を受けやすいシンプルな定量的な指標です（。アラリら 、2008; Whishaw＆コールズ、1996; Whishaw ら、1997。）及び加齢関連の変更にマウスで（テナントら 、2009）。
2. 試験の定量化部分は、パスタの部分が最初に口の中に置かれるときに始まり、パスタの最後は足から放出され、口の中に消えているときに終了します。
3. ビデオ再生は、（リアルタイムの〜50％）鈍化され、または必要に応じてコマ送りを調整を識別するために、使用されています。
4. 調整するたびに足リリースと再コンタクトパスタピース、改革が一部で足のホールドがある場合、または数字の拡張子、屈曲または外転、内転（図2）があるかを数えている。各調整は左右の足のために別々に記録されます。
5. 足は足のホールドの数字または再配置のない動きとパスタの部分全体にスライドするときの調整はカウントされません 。足の動きはそれがパスタの部分（すなわち、作品の横の動き）と接触していないときにもカウントされません。
6. 食べる時間も発症を食べるとパスタが口の中に消えると終わるで始まる、各試験のために記録されます。我々は、ビデオ再生の表示機能を使用して時間を記録するが、それはまた、通常速度の再生中にストップウォッチで記録することができます。
7. 動物が食べることで一時停止しますが、一部のホールドを保持している場合、一時停止時間は合計時間から減算されます。食べるのポーズは、可聴痛烈に口または中止の外部分のどちらかの動きによって明らかです。
8. 短い断片は、パターンを扱う変更するための試験は、射精の任意の部分の間に、足のビューが隠されている場合の分析から除外、または動物の一部を破るとされる。
9. 一部のラットとマウスは一貫して他の複数の足でより多くの調整を行います。怪我は、事前に傷害試験でより多くの調整を行った足（アラリら 、2008）に影響を与える場合一方的な中枢神経系の傷害モデルでは、片側に障害がより敏感に検出されます。
10. マウスは時々食べるの途中でパスタの部分を削除し、そして、短い休憩の後、それを拾うと食べ続ける。これは、一日の最後の裁判で食べる上で部分的な満腹感とフォーカスの喪失が原因の可能性が最も一般的です。これはさらにそのままマウスで共通なので、我々はこれらの試験を省略しないでください。しかし、作品が削除されている時間は合計食べる時間から減算されます。
11. 無傷のラットでは、作品をドロップすると、しばしば非常に遅れたり、欠席さを食べるの非定型と再開です。そのような試験は、調整や食事時間の分析から除外されています。
12. 前に食べて発症への調整はカウントされません。プリ食い処理の動作は、CNSの損傷に影響されます（例えば、Whishaw ら 、1992;。Whishaw ら 、1986。）、しかし、我々はまだこの時期に前足の調整のための定量的な方法を拡張していない。
13. これらのデータは、以下のようにまとめることができる：（a）個あたり足あたりの調整、個につき（b）の平均摂食時間との調整（調整/時間を食べる）の（c）の速度の平均数。

5。非定型処理のパターンのビデオ分析

1. 非定型処理のパターンは異なる中枢神経系損傷ラットの種類（アラリら 、2008）とrecordiを区別することができますngのこれらの行動は、補足的な分析として有用である。
2. 彼らが頻繁に無傷の動物で認められた場合の処理​​パターンが非定型とみなされます。インタクトな動物は通常、1つの足で食べ始める、"把握の足は"、パスタに低く置かれ、"ガイドの足は、"次に口（図3A、C）の近くに配置されます。同じ足では通常、すべての試験で把握の足です。ラットは多くの場合、最初はパスタの長さに沿って遠く離れて足を置き、作品が短くとして、それらを一緒に移動する。マウスは、通常、両方の足を把握し、ガイドの手足さえ食べるの冒頭で、お互いに近い関係に開催されたと、口に近い位置。両方の種において、足はより対称的な位置、横に並べたり、ピースが非常に短い場合、介在する数字がある（図3B、D）に移動します。両方の足を食べる時に、指針となる保有またはパスタを推進するために継続的に使用されています。
3. ラットとマウスの足の位置における非定型パターンは、次のとおりです。パスタの部分が長い場合（A.）は、対称ホールドで、一緒に足を置くこと（半分以上元の長さ）、（B.）に足を移動する失敗作品は完全に消費し、（c）とする前に、対称の位置は、食べるの真っ只中にガイドと把握の手足の位置を切り替える。
4. ラットとマウスの二つの追加の非定型的な動作は以下のとおりです（A.）食べる（"通信に失敗した"）と（B.）を介してパスタを引っ張って口を使用中に長時間用の足とパスタの部分を連絡する失敗前足（"口が引っ張って"）、それらを再配置する。
5. 二つの動作は、ラットに対する非定型と考えられるが、マウスのための典型的なものされています：（A.）猫背の姿勢と（B.）始まるを食べた後にパスタの部分を落とす。しかし、マウスのドロップの頻度は、中枢神経系の損傷後に増加する可能性があります。従って、我々は両方の種でドロップ周波数を記録。
6. 他の非定型行動はラット片側線条体ドーパミンの枯渇のモデルで確認されています：把握の肢が食べる時に動かない、堅い位置に保持されている（A.）"鉄のグリップ"、、（B.）は、ガイドの足の動きを繰り返す堅い把握の足、および（℃）とパスタが口の中に傾いていると頭の極端な傾斜の周りに（。アラリら 、2008; Whishaw らも参照してください1997年）。
7. 我々は、老齢マウスで頻繁に口の中にパスタを移動するための非効果的な調整を行うことを観察した。このように、口の中にパスタピースの目に見える動きでは発生しないの調整が別々に記録されます。
8. 他のすべての非定型行動は試験ごとに一度記録されている間、スイッチングガイドと把握手足、お問い合わせに失敗、ドロップ、および引っ張り口は、発生ごとに記録されます。

6。代表的な結果

ビデオ分析の結果は、試験ごとに各足の調整の数とそれぞれのパスタの部分を食べるために時間を含める必要があります。感覚運動皮質病変や脳虚血によるラットの結果から、動物が障害（コントラへの病変）肢、傷害後の1か月間だけ耐える効果がより少ない調整を​​行うことを示している。対側肢との調整の減少と同側の肢（アラリら 、2008）との調整の増加の両方の一方的なドーパミンの枯渇の結果。マウスからの結果は、高齢の動物は、若い成体マウス（テナントら 、2009）と比較して、パスタの部分を食べるのに時間がかかる、と口の中にパスタの発展につながるしないより多くの調整を行うことを示している。これらのテストの分析はまた、非定型処理の動作の観察を含めることができます。線条体損傷と中大脳動脈の閉塞はさらに、異常な食行動（アラリら 、2008）の頻度の増加をもたらした。

図1（A）ラット及び（B）マウスのパスタの取り扱い姿勢。ラットは、足の動きを表示するためにマウスの下の鏡の配置を必要と、パスタの上のマウスの予感しながら、ふんぞり返っていられるほど後ろに座ることに注意してください。 （C）パスタの部分の例としては、テストのために準備。

図2（AC）ラット及び（DF）マウスの例の前足の調整。最初のパネルは調整前の動物を示し、中央のパネルには、調整足（s）を示すアスタリスク（*）で、前足の調整を示して、そして最後のパネルは、パスタピースの交換を示しています。

図3。ガイドとパスタが（、C）の長と（B、D）短い場合、ラットとマウスの四肢の位置を把握する。

Discussion

このビデオでは、我々はそれぞれ、春雨とカッペリーニ処理試験がラットとマウスで行われている方法を示します。これらのテストは、脳の運動系の損傷後、またはエージング中、通常の動物で足と桁の機能を研究するために、単純な、定量的な方法です。足と研究者がそれぞれの足で行った調整だけでなく、実験的に誘発中枢神経系の損傷後の見られる異常な行動を観察し定量化するための調理パスタの小さな断片を処理するために使用される数字の動きのスローモーションビデオ分析。テストセッションは、異なる日に繰り返し行われ、ほとんどの動物は、数分以内にセッションのすべての試験を完了することができます。したがって、テストは、大規模なテストのバッテリーや実験計画への組み込みに適しています。テストはまた（Xu ら 、2009）運動技能の学習の研究に使用されるが、ここでは、時間をかけて確立されたスキルのアッセイの変化へのプロトコルを提示することができます。

現在、熟練した広範囲のテストは、ラットの器用な前肢の機能の最も一般的に使用されるテストです（例えば、Whishaw ら 、1986;。Ballermann ら 、2001;。。モントーヤら 、1991）およびマウス（ファー＆Whishaw、2002;テナント＆ジョーンズ、2009;ベアードら 、2001）。。パスタの処理は両手作業であるのに対し、到達テストは、各肢の隔離されたテストを許可する。それにもかかわらず、テストでは、両方のテストのために熟練した前足の機能とスキルの獲得の障害に対する感受性に類似している運動野（Xu ら 、2009）の前肢表現の可塑性を伴います。我々の経験では、到達テストはより複雑で実行するために骨の折れるであり、いくつかの実験的な質問については、本試験では、より効率的な代替手段を提供することがあります。しかし、ここで説明したテストとは異なり、熟練到達テストは数十年の使用（ピーターソン、1934）にされていると、彼らは今非常に敏感な対策とテストパラメータ（Ballermann ら 、2001の多目的なセットを含んでいる;。ファー＆Whishaw、2002;モントーヤら、1991;。Whishawら、1992）。。対照的に、春雨とカッペリーニ処理試験は、ラットの巧みな食品の処理動作（Whishawとコールズ、1996）の比較的最近の特徴付けから延びる。管理と分析の両方で、これらのテストは間違いなく、より正確に細かい数字と両手の動きのパターンを定量化し、舌、口や顎の協調運動を定量化する、など、さらに洗練された、拡張可能性があります。